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环孢霉素是由膨大弯颈霉产生的、含有11个正常或非正常氨基酸组成的非核糖体多肽。目前发现了60多种环孢霉素结构类似物，其中环孢霉素A是一种免疫抑制剂，已被开发成为商业药物，但其生物合成机理尚不完全清楚。此外，对真菌合成环孢霉素的生物学功能也鲜有研究。 本论文在前人完成膨大弯颈霉（后简称弯颈霉）基因组研究的基础上，推测出了环孢霉素的合成基因簇。该基因簇包含有simA（非核糖体多肽合成酶，NRPS）、simB(D-丙氨酸消旋酶)、simC（亲环素）、simD（ABC转运蛋白）、simG(聚酮合酶，PKS)、simI(细胞色素P450)、simJ（转氨酶）和simL（bZIP转录因子）等14个功能基因。为了阐明这些基因的作用与功能，我们开展了系列基因缺失、底物饲喂及产物分离鉴定等研究，完整地解析了环孢霉素的生物合成机理。同时，通过开展抗真菌活性及昆虫生物测定等，揭示了环孢霉素对于其合成菌株的潜在生物学功能。 比较野生型菌株(WT)与不同基因缺失突变株的产物合成特征表明，simA，simG，simI，simJ和simL5个基因的缺失，导致弯颈霉完全丧失了合成环孢霉素的能力;而simB的缺失，显著降低了弯颈霉合成环孢霉素的能力。simA基因编码含有11个模块（modules）的非核糖体多肽合成酶，每个模块负责一个氨基酸的加入、修饰、传递和延伸结构域，最终形成11个氨基酸肽链，经过末尾的CT-domain环化成环孢霉素。 环孢霉素的第一底物为D-丙氨酸，功能分析表明SimB消旋酶参与将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸。将此基因敲除后，检测到突变株中的环孢霉素产量显著降低。D-丙氨酸底物饲喂ΔsimB，突变株的环孢霉素产量提高4倍左右。基因缺失及产物鉴定分析表明，聚酮合酶基因simG、细胞色素P450基因simI和转氨酶基因simJ一起负责合成含有9个C的非正常氨基酸Bmt ((4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyl-L-threonine)。 预测的合成基因簇中包含有两个转录因子基因simL和sirmN，分别编码一个亮氨酸拉链转录因子(bZIP)和一个锌指转录因子，基因敲除后发现仅simL敲除突变株不再产生环孢霉素，证明simL在环孢霉素合成过程的正调控作用。在WT菌株中过表达simL基因， RT-PCR检测发现环孢霉素合成相关基因表达量显著上调，同时该菌株的环孢霉素产量较WT菌株提高了25.7％。基因敲除ABC转运蛋白simD基因后发现，ΔsimD胞内环孢霉素A的含量是WT的4倍，揭示了此蛋白负责环孢霉素的胞外运输。 由于环孢霉素具有抗真菌活性，我们的研究还发现，不同基因的缺失影响弯颈霉的生长速率。同WT相比，丧失环孢霉素合成能力的突变株ΔsimA生长速率显著提高。另外，外源添加环孢霉素A能显著降低弯颈霉生长速率，进一步证明环孢霉素对弯颈霉生长具有抑制作用。同WT相比，不能合成亲环素的突变株ΔsimC生长速率显著下降，证明亲环素SimC参与消解环孢霉素产生的毒害作用;同WT相比，添加外源环孢霉素A能更显著降低ΔsimD突变株的生长速率，证明该转运蛋白也参与环孢霉素的解毒功能。将WT与不同基因突变株与曲霉菌进行配对培养的试验进一步表明了环孢霉素的抗真菌活性。使用大蜡螟幼虫进行真菌孢子注射的生物测定表明，环孢霉素合成能力的缺失显著影响弯颈霉的杀虫毒力。 总之，本研究通过开展分子遗传学、生物化学及化学生物学等研究，完整解析了膨大弯颈霉生物合成环孢霉素的分子机理，证明了环孢霉素的抗真菌及促进杀虫的生物活性，研究成果不仅丰富了真菌次级代谢的理论知识，其中正调控转录因子simL的功能验证，也为通过基因工程手段提高环孢霉素的效价提供了重要的技术支撑。