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昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫发育、觅食、交配、生殖以及栖境选择等生命活动过程中发挥着感知外界化学信号的重要作用。本论文以重要的检疫性害虫--桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)为试虫,克隆了桔小实蝇气味结合蛋白基因BdorOBP分析了BdorOBP基因的时间、空间及性别表达特征;对BdorOBP进行了原核表达、分离纯化;应用GC-EAD技术筛选了桔小实蝇寄主植物--柑橘水果中对桔小实蝇具有触角电生理活性的物质,并应用荧光猝灭方法研究了这些化合物与BdorOBP的结合特性;应用Discovery Studio 2.1软件模拟了BdorOBP与活性化合物的结合,确定了结合过程中蛋白的关键氨基酸;应用T7噬菌体展示技术进行了BdorOBP互作蛋白的筛选,为进一步研究昆虫的OBPs信号传导途径及功能奠定了基础。主要结果如下:
1、根据GenBank中登录的昆虫气味结合蛋白氨基酸序列,设计简并引物,采用RACE技术,以桔小实蝇触角cDNA为模板,克隆了BdorOBP基因的全长序列,GenBank登录号为EU564816。分析表明,BdorOBP ORF区域包括148个氨基酸,其中N端前23个氨基酸为信号肽,成熟肽包含125个氨基酸。选取36个昆虫气味结合蛋白序列进行氨基酸序列相似性分析,结果表明BdorOBP与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的气味结合蛋白XP_001999215.1相似性最高,序列相似度为75.8％;与豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的气味结合蛋白ACI30694.1及桃蚜(Myzus persicae)的气味结合蛋白ACJ64043.1相似性最低,相似度都为12.1％。
2、采用real-time PCR的方法对BdorOBP在桔小实蝇不同发育时期、不同组织中的表达特征进行分析。结果表明,BdorOBP在昆虫触角中的表达量最高,其次为雌虫前足;BdorOBP在雌雄虫腹节的表达量最低;雌虫前足中的表达量是雄虫前足中的表达量的116.59倍;而雄虫生殖节中的表达量是雌虫生殖节中表达量的8.5倍。发育性表达研究发现BdorOBP从10天蛹期开始表达;刚羽化雌虫的表达量是刚羽化雄虫表达量的8.75倍。
3、构建了BdorOBP原核表达载体pET-28a(+)-BdorOBP,并采用IPTG诱导的方法在大肠杆菌BL21(DE3)中表达N端带有6×His标签的融合蛋白。凝胶分析表明分子量大小约为25KDa,融合蛋白以可溶态及包涵体形式存在。用Western blot分析表明,表达的融合蛋白为重组目的蛋白。
4、用Ni-His亲和纯化的方法对可溶态融合蛋白进行纯化,用凝血酶酶切纯化的重组蛋白,产物经过His亲和柱的纯化除去标签。进一步采用SDS-PAGE电泳及Western blot的方法验证,结果表明融合蛋白的His标签已经切除完全。
5、用水蒸气蒸馏法提取了柑橘果实精油,用GC-EAD方法筛选到8种具有生理活性的化合物。1-NPN对BdorOBP的内源荧光具有猝灭效应,而且随着浓度的增加,猝灭效应增强。用Scatchart plots方法线性化后计算得到1-NPN与BdorOBP的解离浓度为3.035μM。竞争结合试验表明5种化合物在409nm处有荧光发射现象,未进行进一步的结合特性研究,另外3种化合物3-苯基-1-丙醇、2-苯乙醇、苯甲酸的解离参数分别为1.86μM、2.34μM、4.55μM,说明3种化合物与BdorOBP的结合能力依次为3-苯基-1-丙醇>2-苯乙醇>苯甲酸。
6、利用Discovery Studio软件,同源模建了BdorOBP的初始三维结构模型,对模型进行动力学优化后得到BdorOBP最优构象。利用CDOCKER对接程序进行了BdorOBP与三种化合物的模拟结合研究,计算得到3-苯基-1-丙醇、2-苯乙醇和苯甲酸与BdorOBP蛋白的结合能依次为-25.50 kcal/mol,-22.92 kcal/mol和-17.16 kcal/mol,说明3种化合物与BdorOBP的结合能力依次为3-苯基-1-丙醇>2-苯乙醇>苯甲酸,该结果与荧光结合试验结果一致。对接结果表明HIS110和PHE122均能与供试化合物形成氢键,在BdorOBP与化合物的结合中起到关键作用。
7、构建了桔小实蝇触角及前足cDNA的T7噬菌体展示文库,初始文库中包含的克隆数大约为1.65×106pfu,符合cDNA初始文库的要求;对初始文库进行放大,放大后文库的滴度为4.64×109pfu/mL。以去除His标签的BdorOBP为诱饵蛋白,对噬菌体展示文库进行4轮淘筛。随机挑取了72个噬菌斑单克隆,以T7 Select UP Primers及T7 Select DOWN Primers为引物进行PCR验证,进一步用T7抗体对72个克隆进行ELISA检测,结果表明有21个克隆为阳性克隆。对21个阳性克隆测序并进行序列比对分析表明多个克隆的序列相互重复,阳性克隆分别为丝氨酸蛋白酶、Take Out蛋白、二硫化异构酶、细胞色素氧化酶P450等和2个新蛋白。这些克隆的获得,为进一步研究BdorOBP在信号传导中的作用奠定了基础。