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猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis,TGE),该病是以腹泻,呕吐及严重脱水为临床特征的高度传染性肠道疾病,可以感染各个年龄段的猪群,尤其两周龄以内的仔猪致死率可达100%。它给养猪行业带来极大的损害。TGEV是一种单链正向RNA病毒,属于冠状病毒家庭。它有四种结构蛋白,分别是纤突蛋白S、膜蛋白M、核衣壳蛋白N和小膜蛋白E。其中S蛋白与TGEV的受体结合和膜融合有关,它是TGEV诱导中和抗体产生的主要诱导物。通过对S蛋白的深入研究,发现S蛋白是由两个结构区域组成:S1蛋白和S2蛋白,S蛋白在病毒表面以三聚体结构形成纤突,S2蛋白连接S1蛋白与病毒囊膜,S蛋白携带主要的B淋巴细胞表位,诱导产生中和抗体。S蛋白的4个主要抗原位点(A、B、C、D)存在于氨基端S1蛋白结构中。A位点是诱导中和抗体产生的主要部位。作为TGEV主要的抗原,S1蛋白通过共转译糖基化实现抗原性。S1蛋白含有细胞受体结合决定域,在病毒与宿主细胞结合过程中起着决定性的作用。目前TGEV是冬季仔猪腹泻重要病原,给养殖业造成巨大的损失,本研究通过探讨TGEV S1蛋白与宿主细胞蛋白相互作用,为阐明该病毒致病机理提供理论依据。主要研究内容如下:(1)TGEV S1蛋白诱饵质粒的构建及诱饵蛋白的检测以构建的pMD-19T-S1为模板,扩增TGEV S1基因序列。用EcoRI和SalI对S1基因片段和酵母表达载体pGBKT7双酶切,重组为诱饵重组载体pGBKT7-S1,再转化至酵母菌株Y2HGold。对诱饵蛋白进行蛋白表达,毒性检测和自激活的三方面检测,Western-blot检测诱饵蛋白S1能正常表达,含有pGBKT7-S1的酵母菌与含有空载体的酵母大小相同,数量一致,说明诱饵蛋白S1对酵母菌没有细胞毒性。含有pGBKT7-S1的酵母能在营养缺陷型培养基SD/-Trp/X-α-Gal/AbA生长,即出现蓝色克隆子,表明诱饵蛋白S1对酵母菌存在自激活现象。(2)酵母双杂交技术筛选与S1蛋白互作的宿主蛋白参考Matchmaker?Gold Yeast Two-Hybrid System,含有pGBKT7-S1酵母菌Y2HGold和含有IPEC-J2 cDNA文库的酵母Y187进行杂交。观察其在营养缺陷性培养基SD/-Trp/-Leu/-Ade平板上的生长情况。增加筛选压力,长出的白色克隆子涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His平板进行第二轮筛选,SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA平板用于第三轮筛选,筛选得到蓝色克隆子即阳性克隆,进行BLAST同源性分析,筛选获得12种候选蛋白。其中UBXN1在阳性克隆子的重复率高,并且对RNA病毒诱导的I型干扰素反应有强烈的抑制效果,选为进一步研究与TGEV S1相互作用的候选蛋白。(3)GST pull-down体外验证S1蛋白与候选蛋白UBXN1是否存在相互作用构建重组表达载体pGEX-4T-S1和pET-28a-UBXN1,转化至E.coli Rosseta感受态细胞分别诱导表达融合蛋白GST-S1和His-UBXN1,纯化的融合蛋白GST-S1与HisUBXN1进行GST-pull down,洗脱的蛋白进行Western-blot检测,结果显示TGEV S1蛋白与UBXN1存在相互作用。(4)初步验证候选蛋白UBXN1对S1蛋白是否存在蛋白功能以候选蛋白UBXN1基因的CDS区序列为靶标,筛选RNAi的靶位,设计合成三条siRNA片段。siRNA片段转染至IPEC-J2细胞,转染后孵育TGEV Miller病毒液,荧光定量PCR测定TGEV S1基因的转录水平降低,Western-blot检测TGV S1蛋白表达减少,MTT空斑形成实验发现TGEV复制受到抑制。以上结果表明,小肠上皮细胞中UBXN1与TGEV S1蛋白的作用关系呈正相关,可影响病毒的复制,该研究为进一步探索有效防控TGEV感染的靶蛋白提供理论依据。