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背景： 我们前期研究首次报道血管内皮生长因子A（VEGFA）基因c.454C>T无义突变与先天性左室流出道梗阻（LVOTO）发生有关。然而c.454C>T突变体的功能尚需进一步研究。 目的： 构建人野生型和突变型（c.454C>T）VEGFA基因重组真核表达载体，分别检测其在人胚胎肾细胞（HEK293T）中的转录和表达，进一步探讨VEGFA基因c.454C>T突变体在LVOTO中的发病机制。 方法： (1)采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）从人脐血单核细胞中扩增人VEGFA基因，克隆入质粒pGEM-T，用限制性核酸内切酶BglII和SalI双酶切后连接真核表达质粒PEGFP-N1构建重组载体（野生型pEGFP-N1-VEGFA），通过BglII和SalI双酶切和测序进行鉴定。 (2)以此野生型 pEGFP-N1-VEGFA为模板，采用重叠延伸 PCR技术构建c.454C>T突变型人VEGFA基因重组真核表达载体（突变型pEGFP-N1-VEGFA），同样经双酶切和测序鉴定。 (3)用脂质体法将野生型和突变型pEGFP-N1-VEGFA转染HEK293T细胞，采用荧光显微镜观察重组载体VEGFA和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白的表达，以实时荧光定量PCR检测VEGFA mRNA的表达。 结果： (1)野生型和突变型pEGFP-N1-VEGFA被双酶切为4697 bp和1251 bp两条条带。测序结果证实野生型pEGFP-N1-VEGFA VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致，突变型pEGFP-N1-VEGFA除第454位碱基C被T替代以外，其余序列与野生型完全一致。 (2)在经转染的HEK293T细胞内观察到绿色荧光，而且野生型pEGFP-N1-VEGFA转染组荧光强度明显高于突变型pEGFP-N1-VEGFA转染组，表明突变型pEGFP-N1-VEGFA转染组的EGFP表达少于野生型pEGFP-VEGFA转染组，间接提示突变型pEGFP-N1-VEGFA转染组的VEGFA蛋白表达少于野生型pEGFP-N1-VEGFA转染组。 (3)突变型 pEGFP-VEGFA转染组 VEGFA mRNA表达明显低于野生型pEGFP-N1-VEGFA转染组（X2=6.45，P=0.04）。 结论和研究意义： (1)成功构建了野生型及c.454C>T突变型人VEGFA基因重组真核表达载体，并且在HEK293T细胞内获得瞬时表达。(2)在HEK293T细胞中，初步表明了c.454C>T VEGFA突变体导致VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均下调，为VEGFA突变体参与LVOTO的发生提供了初步实验证据，具有源头创新性。 本课题对进一步阐明LVOTO的发生机制具有重大的理论价值，对先天性LVOTO的遗传咨询、产前基因诊断、疾病筛查乃至干预措施的建立均具有重要的临床应用前景。