论文部分内容阅读
血栓性疾病严重危害人类的健康和生命,研制开发特异、高效、安全的溶血栓药物,成为近年来人们研究的热门课题。微生物是溶栓药物的重要来源之一,微生物中的益生菌株所产生的纤溶酶具有溶栓效果好,无毒副作用,不引起内出血,半衰期长等优点。因此,开发微生物纤溶酶制剂具有极为广阔的前景。
本研究从土壤中分离筛选出一株具有较高纤溶活性的菌株BS-3,通过生理生化反应及16S rDNA基因序列分析对BS-3菌株进行了鉴定。生理生化反应显示BS-3菌株大部分特征与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相似。将16S rDNA序列在NCBI网站中进行同源性比较,利用Neighbor-Joining法绘制系统发育树,结果显示BS-3菌株与Bacillus subtilis的16S rDNA序列同源性达到100％,所以,结合生理生化反应及16SrDNA基因序列分析鉴定BS-3为Bacillus subtilis。
对Bacillus subtilis BS-3菌株进行发酵条件优化,优化后发酵培养基组成为:玉米粉5g／L,豆饼粉10g／L,CACl2·2H2O0.5g／L,NaCl0.5g／L,NaH2PO4·2H2O2g／L,Na2HPO4·12H2O4g／L,MgSO4·7H2O0.2g／L；最佳发酵工艺条件为:发酵培养基初始pH值7.0,装瓶量50 mL／250 mL,接种量为4％,发酵温度37℃,旋转摇床转速200r／min,发酵周期60 h,在该条件下发酵液中纤溶酶酶活力为624.159 U／mL,是初始发酵培养基的4.3倍。
通过硫酸铵盐析的方法提取纤溶酶,等电聚焦电泳检测纤溶酶的等电点,DEAE-Sepharose阴离子交换层析和聚丙烯酰凝胶电泳等方法,对纤溶酶进行分离纯化,得到两个单一活性组分(BsFE-1和BsFE)。SDS-PAGE测得BsFE-1的分子量为48kD,BsFE分子量为43 kD。测得BsFE N-端15个氨基酸序列为AKLDETLTMLKDLTD。纤溶酶BsFE属于含二硫键和会属离子的丝氨酸蛋白酶类,作用最适温度为37℃,最适pH值为8.0,Ca2+、Na+对BsFE有激活作用。分别用胰蛋白酶、胃蛋白酶、胆盐体外处理BsFE,结果显示,胰蛋白酶和胆盐对BsFE活性无影响,在pH3.0环境下BsFE被胃蛋白酶水解后纤溶活性略有降低。利用酶促反应动力学测得BsFE的Km值为2.6 mg／mL,最大反应速度Vmax为1.0 mol／(L·min)。
根据氨基酸编码序列的同源性设计引物,并且在5’端分别加入EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位点,以BS-3菌株的基因组DNA为模板,利用设计的引物进行PCR,获得一个完整的纤溶酶基因bsfe,并且两头含有酶切位点。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切载体pET-30a和bsfe基因,并连接构建了重组质粒pET-30a-bsfe,并对其进行了测序。结果表明:bsfe基因全长约1086 bp,编码361个氨基酸。
将重组质粒pET-30a-bsfe利用热激转化法转化大肠杆菌ER2566,经IPTG低温诱导后,SDS-PAGE检测胞外含有表达条带,表达产物相对分子量大小为43 kD,与BsFE大小一致。
大量发酵含有重组质粒pET-30a-bsfe的大肠杆菌ER2566,IPTG诱导后,用镍柱亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示在43 kD有单一条带。经纤维蛋白平板法检测,表达产物具有纤溶酶活性。