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第一部分褪黑素对人增生性瘢痕成纤维细胞DNA甲基化的影响目的:探讨褪黑素对人增生性瘢痕成纤维细胞（HSFB）DNA甲基化的影响方法:1.收集人增生性瘢痕组织12例,组织块法分离培养取第4代人增生性瘢痕成纤维细胞,用免疫细胞化学法（ICC）鉴定成纤维细胞。2.酶消化法消化细胞,接种于96孔板中,分别加入不同浓度褪黑素组(0、1x10-5、1x10-3、1mmol/L)。分组培养48h后,采用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（WST-1）检测成纤维细胞增殖活性,倒置显微镜观察其形态变化,选取合适浓度的褪黑素实验组作为后续实验组用药浓度;3.实验分成两组:（1）对照组:细胞消化传代后,加入4ml FBS,培养48h;（2）褪黑素组:细胞消化传代后,加入含有褪黑素浓度为10-3mmol/L的10%FBS 4ml,培养48小时后收集细胞;采用荧光定量聚合酶反应（realtime fluorescence quantitative PCR,RT-PCR）和免疫印迹法（Western Blot）检测对照组与褪黑素组间成纤维细胞DNMT1 mRNA的表达量和DNMT1蛋白的含量;结果:1.成纤维细胞形态学观察及鉴定 组织块法培养的人增生性瘢痕成纤维细胞,倒置相差显微镜观察,细胞呈旋涡状或者鱼群样生长特点,细胞核呈类圆形,胞体呈扁平多角形或者梭形,ICC法观察:DAB染色示:细胞突起较多,呈多角星形或纺锤形,细胞体积大,胞质呈棕黄色。成纤维细胞中波形蛋白（Vimentin）呈阳性表达。2.不同褪黑素浓度对HSFB生长形态的影响 倒置相差显微镜下观察不同浓度褪黑素对成纤维细胞生长状态的影响,不同浓度褪黑素作用下成纤维细胞形态规则,呈鱼群集落样生长。不同浓度褪黑素对增生性瘢痕成纤维细胞生长形态无影响,提示褪黑素对成纤维细胞的活性没有直接的毒害作用。3.不同褪黑素浓度对HSFB增殖的的影响 WST-1结果显示:（1）对照组和褪黑素浓度为1x10-5mmol/L组相比,成纤维细胞的增殖活力无统计学意义（P>0.05）;（2）与对照组相比,褪黑素浓度为1x10-3、1mmol/L对人瘢痕成纤维细胞的增殖具有抑制作用,成纤维细胞增殖活力明显低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;（3）褪黑素浓度为1mmol/L与浓度为1x10-5、1x10-3mmol/L的褪黑素组相比,差异均有统计学意义(P<0.05。根据实验结果所示,选取浓度为10-3mmol/L作为后续实验组用药浓度.4.褪黑素对HSFB中DNMT1 mRNA表达及蛋白含量的影响 RT-PCR检测显示褪黑素组DNMT1 mRNA表达量为1.86±0.094,明显高于对照组DNMT1 mRNA（1.00±0.082）表达量（P<0.05）,差异有统计学意义;Western Blot法结果显示褪黑素组的DNMT1蛋白含量为0.20±0.066,高于对照组DNMT1蛋白含量（0.12±0.062）（P<0.05）,差异具有统计学意义。结论:1.不同浓度褪黑素对人增生性瘢痕成纤维细胞的活性无影响;2.褪黑素可抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖;3.褪黑素可以提高人增生性瘢痕成纤维细胞中DNMT1 mRNA和蛋白的表达,提示褪黑素可以提高人增生性瘢痕成纤维细胞DNA甲基化的水平。第二部分褪黑素对去甲基化作用后的人增生性瘢痕成纤维细胞转化的影响目的:探讨褪黑素对去甲基化作用后的人增生性瘢痕成纤维细胞转化的影响方法:收集人增生性瘢痕组织8例,组织块法分离培养取第4代人增生性瘢痕成纤维细胞,实验分成四组:（1）单纯培养基组;（2）褪黑素组(浓度为1x10-3mmol/L);（3）褪黑素+地西他滨（DAC）组;（4）DAC组;培养48h后,采用Western Blot法检测各组间α-SMA蛋白的含量变化。结果:Western Blot法结果显示褪黑素组α-SMA含量为0.63±0.148;褪黑素+DAC组α-SMA含量为0.44±0.267;DAC组α-SMA含量为0.48±0.167,均低于单纯培养基组（0.87±0.089）α-SMA蛋白水平,差异均有统计学意义（P<0.05）。褪黑素组与褪黑素+DAC组相比,差异无统计学意义（P>0.05）;褪黑素+DAC组与DAC组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.褪黑素可以减少人增生性瘢痕成纤维细胞中α-SMA蛋白的表达;2.甲基化酶抑制剂（DAC）可减少增生性瘢痕成纤维细胞中α-SMA蛋白的表达。