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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是一种重要的人兽共患病原菌,可引起人和动物的皮肤与软组织化脓性炎症、心内膜炎、肺炎等多种疾病。由于MRSA极易形成生物膜、具有多重耐药性和免疫逃避性,使其感染易于慢性化且难以彻底治愈,给畜禽养殖业的健康发展和公共卫生安全带来威胁。胞间多糖黏附素(Polysaccharide Imercellular Adhesin,PIA)在葡萄球菌生物膜形成过程中发挥着重要作用。PIA由ica操纵子控制合成,该操纵子包含1个阻遏基因icaR和4个功能基因(icaA、icaD、icaB、icaC)。已有研究发现当icaA和icaD基因共表达时,可大大提高N-乙酰葡糖胺转移酶活性,进而促进PIA合成,但icaA/D基因在MRSA生物膜形成中的作用仍需确证。本研究在检测41株MRSA分离株的耐药性、生物膜形成能力及其相关性的基础上,利用基因同源重组技术构建MRSA安徽分离株icaA/D基因缺失株,通过比较分析野生株和缺失株的耐药性和生物膜形成能力,明确icaA/D基因在MRSA生物膜形成和耐药性产生中的作用,从而为寻找药物作用靶点,研发有效治疗药物奠定基础。本研究内容和结果主要包括以下几个方面:1 MRSA分离株的耐药性检测采用K-B纸片扩散法和微量肉汤稀释法测定41株受试MRSA分离株对14种抗菌药物的耐药性及其最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC),同时采用PCR方法检测受试MRSA分离株携带耐药基因的情况。结果显示,除替考拉宁和万古霉素外,受试MRSA分离株对青霉素、苯唑西林、头孢他啶、克林霉素、阿奇霉素、环丙沙星、强力霉素、四环素、头孢噻肟、庆大霉素、丁胺卡那和氯霉素均呈现耐药,耐药率和MIC值分别为100%(MIC≥0.25)、100%(MIC≥4)、80.5%(MIC≥32)、78.1%(MIC≥4)、63.4%(MIC≥8)、63.4%(MIC≥4)、48.8%(MIC≥16)、46.3%(MIC≥16)、41.5%(MIC≥64)、41.5%(MIC≥16)、39.0%(MIC≥64)和12.2%(MIC≥32)。97.6%(40/41)受试MRSA分离株表现为多重耐药(≥3种),其中3耐、4耐、5耐、6耐、7耐、8耐和9耐的分离株数分别为2、4、11、13、7、3和1;受试MRSA分离株至少携带1种所检测的耐药基因,其中耐药基因mecA、blaTEM、aac(6’)/aph(2”)、aph(3’)-Ⅲ、ErmB、tetM和qacA的阳性检出率分别为92.7%、34.2%、92.7%、63.4%、12.2%、47.5%和63.4%。结果表明受试MRSA分离株的耐药性和多重耐药现象较为严重。2 MRSA分离株的生物膜形成能力检测采用96孔板结晶紫染色法和PCR方法分别对41株MRSA分离株形成生物膜表型及其携带生物膜形成相关基因进行检测,并分析两者间的相关性,以及生物膜形成菌株与非形成菌株的耐药性差异。结果显示80.5%(33/41)受试MRSA分离株可形成不同强度的生物膜;5种生物膜形成相关基因sarA、icaA、icaD、sigB和agr的检出率分别为85.4%、82.9%、70.7%、80.5%和31.7%。定序变量相关性分析结果显示SarA、ica A、icaD、SigB和agr基因与生物膜表型间的相关系数r分别为0.363、0.352、0.431、0.301和0,表明前四种基因与生物膜表型之间存在显著正相关性(0<r<1),但agr基因与生物膜表型间不存在相关性。卡方分析表明生物膜形成菌株与非形成菌株对10种抗菌药物的耐药率存在显著差异(p<0.05),MRSA菌株的生物膜形成能力与耐药性之间存在一定的相关性。3基因敲除质粒的构建与icaA/D基因缺失株的筛选鉴定根据金黄色葡萄球菌N315菌株基因组全序列,分别在icaA/D基因外侧上游和下游设计2对特异性引物,以MRSA M5分离株基因组为模板,分别扩增icaA/D基因上、下游序列。利用重叠延伸PCR方法获得上、下游同源臂融合片段(icaALicaDR)并克隆至穿梭质粒pBT2。提取重组质粒,经双酶切后获得大小约6970bp和1477 bp两条DNA条带,分别与pBT2和融合片段的大小一致。DNA测序结果亦显示2个DNA片段序列和连接顺序完全正确,说明基因敲除质粒pBT2-icaAL-icaDR构建成功。将基因敲除质粒电转葡萄球菌RN4220菌株进行修饰,抽提修饰后的重组质粒电转MRSA M5分离株。通过氯霉素抗性标记和PCR方法双重筛选,得到3株icaA/D基因疑似缺失株。分别用引物对icaA1/icaD2、P1/icaD2、icaA1/S2、P1/S2对疑似缺失株进行组合PCR鉴定,结果分别扩增出大小为1469bp、2202bp、2229bp、2898bp和1477bp的目的基因片段,测序结果亦证明3株icaA/D基因缺失株构建成功。4 icaA/D基因缺失株的耐药性及生物膜形成能力检测为了明确icaA/D基因在MRSA分离株生物膜形成和耐药性产生中的作用,采用微量肉汤稀释法测定14种抗菌药物对野生株和缺失株的MIC值。同时使用盖玻片荧光共聚焦法检测野生株和缺失株的生物膜形成能力及其动态形成过程。结果显示,与野生株相比,icaA/D基因缺失株对抗菌药物的耐药性降低,其中对头孢噻肟、头孢他啶、丁胺卡那、阿奇霉素、克林霉素、四环素、强力霉素和环丙沙星的耐药性发生改变,由耐药转变为敏感或中介;缺失株105的生物膜形成能力显著下降,缺失株24和60则完全失去生物膜形成能力。综上所述,受试MRSA分离株的耐药性和多重耐药现象较为严重,且80.5%分离株具有形成生物膜能力。icaA/D基因在MRSA分离株的耐药性产生及生物膜形成中发挥一定作用。