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研究背景胸腔镜肺癌根治术虽然具有切口小、损伤少、操作精细、出血少等优点,但外科手术损伤肺组织以及淋巴结清扫等因素,患者应激反应和炎性反应依然较大;术后疼痛影响患者正常咳嗽排痰,对术后镇痛需求依然较高。而如何减少手术创伤导致的围术期应激反应以及炎性反应从而加速术后快速康复已经成为当今麻醉学临床研究的热点。患者的术后康复质量是多因素相互作用的结果:手术方式选择、手术时间、应激反应与炎性反应程度、麻醉质量、术后镇痛质量、术后并发症等。早在2001年,丹麦外科专家Kehlet先生就提出了快速康复理念(enhance recovery after surgery,ERAS),意在减少术后平均住院日,提高患者术后恢复质量。ERAS流程中,抑制应激反应和有效术后镇痛是关键环节。胸科手术患者术后因惧怕疼痛,不敢深呼吸、咳嗽排痰受限,导致呼吸道分泌物潴留,堵塞小气道,容易造成肺不张、坠积性肺炎,进一步加重炎症反应,延长住院时间增加治疗成本,甚至威胁患者生命。有效的抑制围术期应激反应和炎性反应以及完善的术后镇痛,有利于提高患者术后生活质量,降低远期并发症的发生率。本试验设计以加快患者术后康复为出发点,采用全身麻醉联合椎旁神经阻滞,静脉复合应用帕瑞昔布,加快患者术后恢复,为今后胸腔镜患者的快速康复提供临床证据。非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)具有良好的抗炎镇痛作用,传统的NSAIDs由于恶心、呕吐、胃出血等副作用,临床上的应用日渐减少。帕瑞昔布是第二代的环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制药,静脉注射后可迅速被肝脏羧酸酯酶水解成高选择性COX-2抑制剂伐地昔布,特异性抑制COX-2阻断花生四烯酸合成前列腺素而发挥抗炎镇痛作用。由于帕瑞昔布对COX-2的高选择性,帕瑞昔布胃肠道的安全性较传统NSAIDs提高,对血小板影响轻微,不影响出血时间。帕瑞昔布超前镇痛可避免术中伤害性刺激引起中枢敏化和疼痛上调,降低围术期的应激反应和炎性反应,预防和减轻术后疼痛。研究表明,p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)的激活体磷酸化-p38丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase,p-p38MAPK)与 COX-2 蛋白表达呈正相关,并且p38MAPK磷酸化被抑制可以导致COX-2蛋白表达出现明显抑制的现象。多种疼痛相关介质或受体比如COX-2、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等都与脊髓小胶质细胞p38MAPK的激活有关。就p38MAPK而言,COX-2就是一种因p38MAPK活化而表达增加的蛋白质。p38MAPK在应激以及炎症介导等大量的细胞反应中发挥关键的作用,并且和细胞的发育、生长以及分化存在密切的联系。目前帕瑞昔布抑制应激反应和炎性反应与p38MAPK的关系还未明确,本研究我们利用光谱学为基础的方法在模拟生理条件下研究了帕瑞昔布与p38MAPK相互作用,通过圆二色光谱技术以及三维荧光等技术来研究帕瑞昔布对p38MAPK蛋白结构的影响,有助于了解帕瑞昔布在体内的作用机理,为进一步研究其体内作用机制奠定了理论基础,对于合理用药及新药的研制开发具有一定的指导意义。第一部分帕瑞昔布对胸腔镜手术应激反应及炎性反应的临床观察目的胸科术后疼痛影响患者咳痰或深呼吸,阻碍术后康复,应激反应和炎性反应也是影响胸科手术术后恢复的一个重要方面。围术期大量促炎性细胞因子的产生将导致过度应激,破坏细胞因子之间的平衡,过度的应激反应会削弱机体生理储备,从而加重炎性反应,激发全身炎性反应综合征(systemicinflammatoryresponse syndrome,SIRS)。术后疼痛机制复杂,炎症性疼痛也是术后疼痛的一个方面。临床上提倡多模式镇痛,不同作用机制的药物或镇痛技术联合使用,并发症少。帕瑞昔布是第二代的COX-2抑制药,通过选择性抑制COX-2,阻止花生四稀酸(arachidonic acid,AA)转化为前列腺素(prostaglandinum,PG)和血栓素A2(thromboxane A2,TXA2),进而发挥解热、抗炎及止痛作用。本研究以行胸腔镜手术的患者为观察对象,观察静脉注射帕瑞昔布对胸腔镜手术应激反应及炎性反应的影响以及对术后镇痛的影响,为ERAS指导下的术后镇痛提供依据。方法本试验经医学伦理学委员会审批同意,选取2016年3月至2017年3月行择期胸腔镜肺叶切除手术40例患者,美国麻醉医生协会(American society of anesthesiologists,ASA)分级为Ⅰ～Ⅱ级,术前签署知情同意书,所有患者均接受全身麻醉复合超声引导下的椎旁神经阻滞。所有患者均采用ERAS理念下的围术期管理模式,术前两小时禁饮,不留置尿管,不用术前药,采用标准化的术前准备和麻醉流程。全身麻醉前行超声引导下的椎旁神经阻滞,注入0.5%罗哌卡因20ml,阻滞后1Omin测麻醉平面,要求麻醉平面在T4-T8。患者被随机分为帕瑞昔布组(P组,n=20)和对照组(C组,n=20),帕瑞昔布组分别于术前(T0)、术后24h(T1)注射帕瑞昔布40mg(生理盐水稀释至4ml),对照组注射0.9%NaCl溶液4ml。分别于手术前(T0)、术后24h(T1)、术后48h(T2)后取动脉血8ml,在4℃条件下以3500r/min的转速离心15分钟。取上层血浆于-80℃低温冰箱保存。全部样本留齐后批量测定动脉血中血浆内皮素(endothelin,ET)、血栓素A2(thromboxane A2,TXA2)、IL-6、TNF-α水平。记录患者的术中使用阿片类药物总量、输液量、失血量、手术时间、24h和48小时视觉模拟评分法(visual analogue scale,VAS)疼痛评分、术后住院时间。结果1、患者一般情况共计40例患者符合标准纳入研究,两组患者在年龄、性别、身高、体重、芬太尼用量、手术时间、失血量、输液量方面无统计学差异(P>0.05)。2、患者术后VAS评分及住院时间患者术后VAS评分在T1时帕瑞昔布组低于对照组(P=0.004),术后VAS评分在T2时帕瑞昔布组低于对照组(P=0.004);相对于对照组,帕瑞昔布组的术后住院天数减少(P=0.007)。3、应激反应与炎性反应指标术前两组患者血浆ET、TXA2、IL-6、TNF-α水平无明显差异(P>0.05)。T1时两组患者血浆ET、TXA2、IL-6、TNF-α水平均高于术前(P<0.05);T2时两组患者血浆ET、TXA2、IL-6、TNF-α水平均高于术前(P<0.05)。与对照组相比,T1时帕瑞昔布组血浆ET、TXA2、IL-6、TNF-α水平明显低于对照组(P<0.05),T2时两组血浆ET、TXA2、IL-6、TNF-α水平无明显差异(P>0.05)。结论静脉注射帕瑞昔布可提高胸腔镜手术患者术后镇痛效果,减少应激反应和炎性反应,缩短患者的住院时间,加快患者术后康复,符合ERAS理念下的多模式镇痛及快速康复要求。第二部分帕瑞昔布与p38MAPK相互作用机制的光谱研究目的p38MAPK影响多种细胞内反应,在炎症、细胞周期调节、细胞死亡、发育、分化、衰老和肿瘤发生中具有公认的作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAKP)是广泛表达的丝氨酸/酪氨酸激酶,在哺乳动物细胞多种信号转导通路中起重要作用。p38信号通路是MAPK通路的一个重要分支,神经细胞在病理因素的刺激下可激活p38MAKP,进而激活MAKP信号通路,分泌白细胞介素1 β(interleukin-1β,IL-1β)和TNF-α等炎性细胞因子,引起神经系统损伤。p38MAPK的激活体p-p38MAPK与COX-2蛋白表达呈正相关,并且p38MAPK磷酸化被抑制可以导致COX-2蛋白表达出现明显抑制的现象。多种疼痛相关介质或受体都与脊髓小胶质细胞p38MAPK的激活有关,如TNF-α、IL-1β、神经激肽1(neurokinin-1,NK-1)受体和COX-2。另外p38MApK激活还可以通过激活COX-2使前列腺素合成进一步增加,参与中枢敏化。帕瑞昔布降低了围术期应激反应和炎性反应,推测其降低TNF-α、IL-1等蛋白表达机制除了直接抑制环氧化酶外,还可能是通过抑制p38MAPK所牵连的通路来起发挥作用的。本研究我们利用光谱学为基础的方法在模拟生理条件下研究了帕瑞昔布与p38MAPK相互作用,通过圆二色光谱技术以及三维荧光等技术来研究帕瑞昔布对p38MAPK蛋白结构的影响;同时对于帕瑞昔布和p38MAPK相互作用的结合位点数、结合常数、热力学常数进行计算。方法采用透射电子显微镜、紫外可见吸收光谱、稳态/时间分辨荧光光谱、圆二色光谱、能量转移等技术研究了帕瑞昔布与p38MAPK的相互作用。结果紫外-可见吸收、圆二色光谱以及三维荧光能够反映出p38MAPK的空间结构以及微环境都因帕瑞昔布结合发生改变,造成p38MAPK整体骨架结构逐渐松散,部分具有疏水性的芳香环氨基酸和多肽链暴露于溶液。根据荧光光谱和透射电镜实验结果,帕瑞昔布可以导致p38MAPK发生团聚,两者可以通过非共价键力作用一静电作用力与p38MAPK以1:1的比例发生结合,形成帕瑞昔布-p38MAPK结合物。帕瑞昔布对于p38MAPK存在一定的荧光猝灭影响,这种荧光猝灭机制归类为静态猝灭;由Stem-Volmer方程计算出在25摄氏度时,帕瑞昔布与p38MAPK的亲和常数KA为8.13 × 104/M;由Van’t Hoff方程计算出△G、△H和△S分别为-2.80X 104 J·mol-1,-1.62×105 J·mol-1·K-1和-450 J·mol-1;这种过程主要是熵驱动的自发分子反应,分子之间的结合距离为3.95nm。结论本研究发现帕瑞昔布导致p38MAPK的空间构象和微环境出现变化。p38MAPK中具有比较松散的骨架结构,同时内部的疏水性的多肽链和芳香环氨基酸不断的发生暴露。分析所有的理论数据以及实验结果显示帕瑞昔布对于p38MAPK结构影响非常显著,并且提供了的帕瑞昔布与p38MAPK相互作用的基础数据。