论文部分内容阅读
目的:
1、研究用于肿瘤磁流体热疗的锰锌铁氧体磁性纳米粒子(Mn0.4Zn0.6Fe2O4,MNPs)的制备及其生物相容性；
2、评价PEI修饰的纳米级Mn0.4ZNn0.6Fe2O4磁性纳米粒子(PEI/Mn0.4Zn0.6Fe2O4)作为基因载体的可行性及外加磁场对于其转染效率的影响；
3、构建用于靶向基因治疗的重组真核表达质粒pHSP-HSV-TK；
4、观察pHSP-HSV-TK复合纳米磁粒联合磁感应加热及核素内照射靶向治疗兔VX2肝癌移植瘤的作用,探讨其靶向治疗肝癌的有效性和可行性。
方法:
1、采用改良的化学共沉淀法制备锰锌铁氧体磁性纳米粒子。利用TEM、XRD、SEM-EDS、VSM、Perkin-Elmor7系列热分析系统等手段对其形貌、物象、成份、磁性能及居里温度等进行表征。MTT实验评价其体外细胞毒性;溶血试验评价其有无溶血作用；小鼠腹腔注射材料混悬液以测定其LD50；微核试验评价其有无致畸、致突变作用:兔肝脏穿刺注射Mn0.4Zn0.6Fe2O4纳米粒后观察形态学及血常规、肝肾功能等指标的改变。2、采用聚乙烯亚胺(PEI)锰锌铁氧体磁性纳米粒子进行表面修饰;透射电镜(TEM)及扫描电镜(SEM)观察修饰前后磁性粒子形貌；傅立叶红外光谱(FTIR)分析磁性粒子表面的官能团变化；光电子能谱仪(XPS)进行磁性粒子的表面成份分析；UV/vis光谱仪检测修饰前后磁性粒子的悬浮稳定性和磁响应性；Zeta电位仪检测磁性粒子在不同pH值下的表面电位；采用Bradford法测定PEI在纳米粒子上吸附量；紫外分光光度计测定不同修饰条件下的磁性纳米粒子的DNA结合保护、体外释放能力及转染能力；体内外加热实验验证其升温恒温能力；应用报告基因,检测PEI/Mn0.4Zn0.6Fe2O4的体内外转染能力及外加磁场对转染效率的影响。
3、设计1对引物,以pHSV-106质粒为模板进行PCR扩增,PCR扩增产物纯化后获得目的基因片段,与pD3SX载体连接后转化大肠杆E.coliDH5α,克隆PCR法筛选菌落,测序鉴定后,大量抽提质粒。磁性转染法将pHSP-HSV-TK导入SMMC-7721,加热处理后,RT-PCR法检测TK基因的整合。
4、通过蛋白交联固化的方法制备丙氧鸟苷白蛋白纳米微球,并测定GCV-BSA-NP的体外释药特性；采用预锡化直接标记法对丙氧鸟苷白蛋白纳米微球进行了188Re标记,同时观察188Re-GCV-BSA-NP体外稳定性；建立VX2肝癌模型并将36只荷瘤兔随机分成6组,分别为(A)空白对照组、(B)单纯加热组、(C)单纯基因转染治疗组、(D)碘油混合基因转染治疗组、(E)碘油混合基因转染联合放疗组、(F)基因、热疗、核素内照射联合治疗组；各组经介入治疗后,观察肿瘤生长增殖情况,计算肿瘤体积增长率,观察肿瘤组织病理变化情况。
结果:
1、自制的Mn0.4Zn0.6Fe2O4纳米粒近似球形,大小较一致,直径约为30～60nm,有部分团聚现象,XRD图对比粉末衍射标准联合会(JCPDS)编制的尖晶石型锰锌铁氧体纳米粒卡片(PowderdiffractionFile)可知自制的Mn0.4Zn0.6Fe2O4纳米粒为尖晶石型锰锌铁氧体纳米粒；SEM-EDS证实Mn0.4Zn0.6Fe2O4纳米粒只含有Mn、Zn、Fe、O四种元素且构成比与分子式近乎一致；VSM曲线中磁滞回线双线合一,说明Mn0.4Zn0.6Fe2O4纳米粒为超顺磁纳米材料；MTT显示该材料对L-929细胞毒性为0～1级；无溶血作用；其LD50值为6.026g/kg;微核实验结果表明无致畸致突变作用；兔肝脏穿刺注射Mn0.4Zn0.6Fe2O4纳米粒磁流体后心、肝、脾、肺、肾组织形态和肝、肾等血生化指标均无明显改变,显示该材料是一种具有良好生物相容性的材料,应用于肿瘤热疗具有广阔前景。
2、修饰后的磁性纳米粒子具有良好的分散性、磁响应性及升温恒温能力；红外光谱及XPS分析验证了PEI在磁性纳米粒子表面的吸附;修饰后磁性纳米粒子的等电点由pH7.0移至pH11.0；具有良好的DNA结合保护转染能力；在体内外,PEI/Mn0.4Zn0.6Fe2O4可将外源基因成功转染并表达;在体外,外加磁场可使转染效率提高5～10倍。
3、获得重组的真核表达质粒pHSP-HSV-TK;经PCR扩增获得的目的基因片段分子量与预计的相同；插入pD3SX载体部位正确,经测序发现插入片段两端序列无改变,且读码框正确；转染pHSP-HSV-TK的SMMC-7721扩增出正确的TK基因条带。
4、丙氧鸟苷白蛋白纳米微球为大小不等的规则性微粒,直径不等,但多集中在250nm-290nm;GCV-BSA-NP总的标记率>90％,放化纯>95％；标记物稳定性观察:标记物放置于37℃的PBS(pH7.4)溶液中,在24h时放化纯为95％；成功建立VX2肝癌模型,且VX2肝癌模型的建立对肝肾功能没有明显的影响；介入治疗后12天,各组肿瘤体积均有增长；单纯加热组与碘油混合基因转染联合放疗组相比,12天后肿瘤生长无显著性差异,但肿瘤增长率均大于基因、热疗、核素内照射联合治疗组,差异具有统计学意义(P<0.05)；碘油混合基因转染治疗组较单纯基因转染治疗组肿瘤体积生长明显降低,且差异有显著性(P<0.05)；介入治疗后12天,C、D、E、F四个治疗组的肿瘤体积增长较对照组均有显著性差异(P<0.05),且以基因、热疗、核素内照射联合治疗组的治疗效果最好,也即肿瘤体积增长率最低；但单纯基因转染治疗组与空白对照组相比,肿瘤体积生长无显著性差异(P>0.05)。
结论:热疗、基因联合放疗能有效抑制VX2肝癌的生长,对肝癌治疗有潜在的应用前景。
1、自制纳米级Mn0.4Zn0.6Fe2O4磁性纳米粒子是一种具有良好生物相容性的材料,应用于肿瘤热疗具有广阔前景。
2、PEI修饰的磁性纳米颗粒是一种可用于体内外转染的新型非病毒基因载体,外加磁场可提高其转染效率。
3、pHSP-HSV-TK质粒构建成功,为利用其进行靶向性基因治疗研究奠定了基础。
4、磁感应热疗、基因治疗、核素靶向内照射放疗的联合能有效抑制VX2肝癌的生长,对肝癌治疗具有潜在应用前景。