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一、研究目的及意义恶性黑色素瘤恶性程度极高、发病隐匿、易发生血行转移、预后差、死亡率高,临床治疗很棘手。随着分子生物学的发展,恶性黑色素瘤的基因治疗尤其是自杀基因治疗为患者带来了希望,成为继传统的手术切除、放疗、化疗等方法后的一种新的抗肿瘤治疗措施。但单纯自杀基因治疗,由于目前载体转染效率较低、靶向性不够等问题没解决,仍有部分肿瘤细胞残余导致肿瘤复发,这是该疗法存在的重大缺陷。旁观者效应即转染基因的阳性细胞对未转染基因的阴性细胞的杀伤效应是自杀基因治疗的显著特点,因而增强旁观者效应目前已成为提高肿瘤自杀基因治疗疗效的重要策略。由于缝隙连接机制是旁观者效应的重要机制,故改善肿瘤的细胞间信息交流(GJIC)是自杀基因疗法增效的重要途径之一。前期研究表明:体内六味地黄丸对恶性黑色素瘤自杀基因治疗具有明显的增效作用,其增效作用与六味地黄丸对机体的细胞免疫和体液免疫的增强作用有关,考虑到中药方药具有多途径和多靶点作用特点,除了免疫机制外,六味地黄丸能否通过旁杀伤效应的其他机制如缝隙连接、细胞凋亡等机制对自杀基因增效呢?本实验拟通过体外实验(排除免疫机制的作用)对其进行论证。本研究应用中药复方血清药理学的方法将自杀基因HSV1-tk/GCV系统与六味地黄丸在体外实验中联合,以小鼠恶性黑色素瘤B16细胞为对象进行了杀伤实验研究与GJIC机制的初步探讨。通过研究以期为临床自杀基因疗法联合中药复方的中西医结合治疗方案的建立提供实验数据和科学依据。二、研究方法:1.恶性黑色素瘤细胞HSV-tk/GCV治疗系统的构建与鉴定:取PT67/tk细胞病毒上清液感染对数生长期的B16细胞,G418抗性筛选阳性克隆命名为B16/tk并扩大培养;提取B16/tk细胞基因组DNA,PCR法对tk基因进行鉴定;加入GCV显微镜下观察tk基因的活性。2.GCV工作浓度及tk~+比例的确定:将B16/tk和B16按照0、10%、20%、40%、100%比例混合,分别加入GCV终浓度为:0μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM,MTT法检测杀伤效率。3.对照血清与含药血清的制备及其对B16细胞生长的影响:SPF级健康SD大鼠30只,随机分成对照组与六味地黄丸组2组。六味地黄丸组每天灌服六味地黄丸研磨液8ml(含生药4g),对照组灌服等体积的蒸馏水,连续灌胃4天,末次给药后1小时腹主动脉取血,制备血清,-70℃冰箱保存备用;设10%新生牛血清组、10%对照血清组、2.5%六味血清组、5%六味血清组、10%六味血清组,MTT法检测各浓度的血清对B16细胞生长的影响。其中六味血清不足10%者,用对照血清补足体积,如2.5%六味血清组添加7.5%对照血清和2.5%六味血清,5%六味血清组添加5%对照血清和5%六味血清。实验所用含药血清均按此比例配比。4.六味地黄丸含药血清对B16细胞株tk/GCV系统治疗增效作用的量效关系:按B16/tk占总细胞数的20%比例混合B16与B16tk细胞,设置10%对照血清组、2.5%六味血清组、5%六味血清组、10%六味血清组、10%对照血清联合GCV组,2.5%六味血清联合GCV组,5%六味血清联合GCV组、10%六味血清联合GCV组,MTT法检测各组细胞的抑制率,用金正钧Q值分析六味地黄丸含药血清与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。5.六味地黄丸含药血清对小鼠恶性黑色素瘤细胞自杀基因治疗增效作用的缝隙连接机制:设10%对照血清组、2.5%六味血清组、5%六味血清组、10%六味血清组,RT-PCR法检测六味地黄丸对B16细胞Cx26和Cx43 mRNA的影响;Western Blot法和间接免疫荧光法检测六味地黄丸对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响;RT-RCR检测Cx26-309、Cx26-337、Cx26-367、Cx26-2098 SiRNA对Cx26的干扰效率,选用干扰效率最高的Cx26-2098 SiRNA干扰Cx26基因后观察六味地黄丸联合HSV-tk/GCV的旁观者效应;设置10%对照血清组、2.5%六味血清组、5%六味血清组、10%六味血清组、10%对照血清联合GCV组,2.5%六味血清联合GCV组,5%六味血清联合GCV组、10%六味血清联合GCV组,2.5%六味血清联合GCV+甘草次酸组、5%六味血清联合GCV+甘草次酸组、10%六味血清联合GCV+甘草次酸组。GCV的终浓度为20μM,甘草次酸终浓度为50μM,MTT法检测各组细胞的抑制率,观察GJIC抑制剂甘草次酸对六味地黄丸联合tk/GCV系统对B16细胞杀伤作用的影响。6.对照血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统治疗及缝隙连接蛋白表达的影响:不同种属与不同制备方法的鼠血清可能对B16细胞株HSV-tk/GCV系统治疗及缝隙连接蛋白表达有影响,设置10%新生牛血清组,10%未灌胃鼠血清组,10%灌胃鼠血清组,10%新生牛血清联合GCV组,10%未灌胃鼠血清联合GCV组,10%灌胃鼠血清联合GCV组,MTT法检测并计算各组细胞存活率;设10%新生牛血清组,10%未灌胃鼠血清组,10%灌胃鼠血清组,RT-PCR法检测各种血清对B16细胞Cx26和Cx43mRNA表达的影响,Western Blot法检测各种血清对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响。三、研究结果1.恶性黑色素瘤细胞HSV-tk/GCV治疗系统的构建与鉴定:PCR结果显示病毒上清液感染后的B16细胞基因组中已经整合了tk基因;加入GCV后,感染组细胞比非感染组细胞死亡大大增加,提示感染后的B16细胞表现出tk基因的生物活性。2.GCV工作浓度及tk~+比例的确定:当GCV浓度达6.25μM以上时对B16/tk细胞表现出一定的杀伤效应,GCV浓度达100μM以上时对B16有一定的细胞毒性作用,选择对B16/tk敏感而对B16无细胞毒性的GCV浓度(6.25μM～100μM),并且发挥最大杀伤效应的最低GCV浓度将是我们实验中的最适GCV工作浓度,故GCV的工作浓度确定为20μM。40%B16/tk与100%B16/tk组在较低浓度的GCV(6.25μM)时,就能杀伤几乎全部细胞(B16/tk与B16),即40%B16/tk细胞混合时比例太高,杀伤效应太强,联合杀伤没有发挥的空间;而B16与10%B16/tk组在GCV浓度很高(100μM)时,杀伤效应也很弱,即10%B16/tk混合时tk~+阳性细胞太少,能输出的毒性代谢产物有限,即使缝隙连接功能增强,也不能提高旁观者效应;20%B16/tk组则既能观察到旁观者效应,又为中药留了足够的发挥空间,故采用20%B16/tk比例混合组。3.对照血清与含药血清的制备以及其对B16细胞生长的影响:MTT结果显示10%牛血清组、10%鼠对照血清组、2.5%六味血清组、5%六味血清组、10%六味血清组细胞存活率分别为:100±1.33%、100.63±1.20%、105.30±0.93%、106.59±2.42%、109.35±2.51%,与细胞培养用10%牛血清比较,2.5%、5%、10%六味血清对B16细胞有增殖作用(P<0.01)。4.六味地黄丸含药血清对B16细胞株tk/GCV系统治疗增效作用的量效关系:2.5%、5%、10%六味血清联合20%tk/GCV组的实际抑制率(48.75%、59.39%、69.28%)显著高于理论抑制率(38.13%、38.67%、39.92%),金正钧Q值分别为1.28、1.54、1.74,均大于1.15,具有增效协同作用。5.六味地黄丸含药血清对小鼠恶性黑色素瘤细胞自杀基因治疗增效作用的缝隙连接机制:六味地黄丸能提高B16细胞中Cx43蛋白与mRNA的表达,且具有量效依赖关系;对Cx26 mRNA与蛋白的表达具有双向调节作用,低剂量时具有抑制作用而高剂量是能上调其表达;SiRNA干扰Cx26基因后,六味地黄丸联合自杀基因治疗的旁观者效应与没有干扰前比较没有明显的变化;2.5%、5%、10%六味血清联合GCV组在甘草次酸阻断前(48.75%、59.39%、69.28%)与阻断后细胞抑制率(29.14%、38.71%、58.13%)相比显著降低(P<0.01)。6.对照血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统治及缝隙连接蛋白表达的影响:新生牛血清、未灌胃鼠血清、灌胃鼠血清对恶性黑色素瘤细胞的生长以及tk/GCV系统治疗无显著性差异;各组血清对B16细胞中Cx43mRNA与蛋白的表达无明显影响,灌胃鼠血清能提高B16细胞中Cx26 mRNA与蛋白的表达水平。四、结论本研究成功构建了B16细胞株HSV-tk/GCV自杀基因系统;在研究中发现六味地黄丸含药血清对自杀基因杀伤恶性黑色素瘤(B16细胞株)具有协同增效作用,其增效作用与缝隙连接机制有关;对其进一步研究表明六味地黄丸可能是通过提高Cx26和Cx43表达而达到协同增效作用。