人可溶性gp190 cDNA克隆、酵母表达系统的构建与生物学活性研究

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该研究对sgpl90在酵母Pichiapastoris中实现了重组sgpl90分泌表达.利用基因重组技术,将编码人可溶性gpl90(LIF受体α亚基gp190胞外区)cDNA克隆到毕赤酵母Pichia pastoris分泌表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-sgpl90.原生质体法转染Pichia pastorisGS115菌株,经过G418筛选,得到了高效分泌表达sgpl90蛋白的毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-sgpl90,sgpl90蛋白占摇瓶培养表达上清中总蛋白质的27%.经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约125 kD,具有免疫活性.获得的sgpl90蛋白为体内外深入研究其生物学活性奠定了基础.该研究第二部分以体外培养滋养层细胞为载体,从sgp190对滋养层细胞增殖、分化,激素分泌,IL-10表达,与侵袭力有关的MMP-9和TIMP-1分泌水平及对Jak1-STAT3信号通路中STAT-3磷酸化水平的影响等几个方面对sgp190活性进行了研究.细胞滋养层分泌的Th1/Th2细胞因子对妊娠的维持起着重要的作用,对妊娠中期滋养层细胞施加LIF和/或sgp190刺激,用ELISA法检测Th2型细胞因子IL-10蛋白,结果显示,LIF刺激IL-10蛋白表达,sgp190无此效应,但sgp190可阻断LIF的作用.第三部分我们对正常能育妇女和原因不明不孕患者植入窗口期(D19-21)血浆中sgp190与LIF进行测定,以探索sgp190在胚泡植入中可能起的生物学作用.第二、三部分研究结果表明:sgp190对局部或整体LIF的活性起负性调节作用,可能是LIF生物活性的一个调节子.通过抑制LIF活性而在滋养层细胞的增殖、分化、侵袭特性等方面具有调节作用,与胚泡植入、妊娠建立与维持相关.其作用机制可能是通过与LIF结合,使局部或整体的LIF有效浓度下降,通过反馈机制,LIF的膜受体gp130与gp190表达减少,下游信号通路活动减弱,从而使LIF的效应受到抑制.
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