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目的： 诱导分化为上个世纪70年代开始兴起的肿瘤治疗方法，最初应用于急性早幼粒白血病的治疗，以后陆续发现有诱导实体瘤分化的作用。就诱导分化而言，有的研究认为细胞周期阻滞在G0/G1期为诱导分化，也有研究认为阻滞在S期或G2/M期为诱导分化。 全反式维甲酸是脂溶性维生素A在体内的衍生物，亚硒酸钠是微量元素硒的氧化物盐。研究表明它们能诱导分化白血病细胞HL-60、NB4及肝癌细胞SMMC-7721，并且可以诱导一些肺癌细胞的增殖率、粘附力、侵袭力下降。非实体瘤的诱导分化主要集中在红白血病和白血病上进行，实体瘤细胞对多种诱导分化剂可有程度不一的诱导反应。可被分化诱导的实体肿瘤有:恶性黑色素瘤、胃癌、淋巴瘤、肺腺癌及鳞癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤、肝癌、乳腺癌、星状细胞瘤、绒毛膜上皮癌、膀胱癌、头颈部癌、喉癌、前列腺癌及早期子宫颈癌等。 研究表明，不同肿瘤对诱导分化的反应性很不一致，就肺癌而言，腺癌、鳞癌可以被诱导分化，而小细胞肺癌仅有少数的几例关于诱导分化方面的报道。Li等人研究了全反式维甲酸和受体亚型选择性维甲酸对人肺癌细胞生长和凋亡的影响，全反式维甲酸能抑制Calu-6和H460的生长，同时诱导RARβ表达，但它们对H292，SKMES-1和H661肺癌细胞系无作用，并且在这些细胞中RARβ没有被诱导表达。 为寻找周期变化的规律，实验选用A549细胞，以药物全反式维甲酸、亚硒酸钠研究剂量效应关系对药物作用效果的影响。 实验选用分化程度相异的A549、A2二株细胞，以药物全反式维甲酸、亚硒酸钠来研究肿瘤分化程度对药物作用效果的影响。 方法： 一、材料 肺腺癌细胞A549、肺囊性腺样癌细胞A2购自中国医科大学肿瘤研究所。全反式维甲酸、亚硒酸钠是Sigma公司产品。Rb、c-myc鼠抗人单抗购自北京中杉公司。Sp-kit试剂盒、DAB液购自福州迈新公司。Western blot所用一抗（鼠抗人caspase3、p21、兔抗人RARα）购自北京中杉公司。羊抗鼠二抗购自Sigma公司，羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司。引物采用primer3软件设计:(1) Bcl-2(151bp)，(2) cycl inD3(230bp),(3) nm23(192bp),(4) Stat3(202bp),(5)β-act in(513bp)。由TaKaRa公司合成，提取总RNA的RNAout由深圳华氏生物技术有限公司生产，RT-PCR试剂盒及DNA聚合酶均购自TaKaRa公司，电泳用聚丙烯酰胺、Tris，甘氨酸及琼脂糖等购自上海生工公司。 A549、A2细胞接种于含10％胎牛血清、PH值7.0-7.2的RPMI1640培养液中，37℃、5％ CO2培养箱中培养，反复传代、培养至实验所需数量。 全反式维甲酸溶于95％乙醇中配成10.0mmol/L贮存液，滤过除菌，-20℃保存，实验前日用培养液稀释至10倍所需浓度。亚硒酸钠于实验前日用双蒸水配成10.0mmol/L，滤过除菌后用培养液稀释至所需浓度10倍。处理药物全反式维甲酸、亚硒酸钠浓度依不同指标对细胞要求分别为:2.5μ mol/L、5.0μ mol/L、10.0μ mol/L、20.0μ mol/L、40.0μ mol/L。、80.0μ mol/L、160.0μ mol/L。芗药物配制浓度一部分结合实验所需，一部分结合临床应用设计。 二、实验方法 1、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测吸光度并筛选浓度 计算每种药物不同浓度的增殖抑制率。 肿瘤细胞增殖抑制率=（对照孔平均OD值-实验孔平均OD值)/对照孔平均OD值×100％ 2、流式细胞仪检测细胞周期变化及凋亡、坏死细胞比例 以流式细胞仪FACSCalibur，BD（美国）于FLA-2参数下检测细胞周期，采集软件Cell Quest3.0采样，分析软件ModFit LT3.0定量分析细胞周期各时期的百分率及凋亡、坏死细胞的百分率。 3、吖啶橙荧光染色观察细胞凋亡及细胞形态变化 避光冷藏状况下于荧光显微镜下观察并照相。激发荧光波长为450-490nm（绿荧光）。 4、倒置显微镜直接观察细胞形态的变化 24小时后各孔于倒置显微镜下直接观察并拍照。 5、 Giemsa染色观察细胞形态变化 固定、染色、脱水、透明，中性树胶封片后于400倍光镜下观察。 6、免疫组化SP法检测癌基因、抑癌基因表达变化 免疫组化结果判断标准连续计数1000个细胞阳性表达细胞数，以黄色或棕色染色为阳性。 7、罗丹明123荧光染色观察细胞线粒体改变 避光冷藏状况下于荧光显微镜下观察并照相。激发荧光波长为450-490nm（绿荧光）。 8、电子显微镜观察细胞超微结构的改变 固定、染色、切片，H-600A型透射电镜下观察并拍照。 9、Western Blot法于翻译水平检测基因蛋白的表达 用GIS-2020凝胶图象分析系统扫描分析结果。 10、 Rt-PCR法于转录水平检测基因mRNA的表达 以β-actin吸光度值标化目的产物吸光度值，得到目的产物相对含量。 目的产物相对含量=强度（泳道1）/强度（泳道2） 抑癌基因上调比例=较对照上调抑癌基因例数/（较对照上调抑癌基因例数+较对照下调抑癌基因例数）×100％ 癌基因下调比例=较对照下调癌基因例数/（较对照下调癌基因例数+较对照上调癌基因例数）×100％ 11、数据处理 数据以（(x)±s）表示，采用多因素方差分析:LSD法，Student-Newman-Keuls法（q检验）做多重比较。卡方检验:Kruskal-Wallis Test法，Median Test检验。基因部分对照组样本均数采用T检验比较。SPSS14.0处理数据。 结果： 药物作用后，经MTT检测，处理组吸光度比对照组明显降低，且呈现出浓度效应关系;经流式细胞仪检测，处理组凋亡细胞及坏死细胞碎片较对照组比例增加，且随浓度增高而增多。随浓度增加，A549的二倍体细胞比例有所增加、异倍体细胞比例有所减少，A2（主要为多倍体）的异倍体细胞比例有所增加;倒置显微镜下观察，处理组细胞折光度降低，细胞皱缩、破碎，边缘不整;A2细胞集落化现象消失，形态由均一大小的小梭形变为多种形态。Giemsa染色显示A549细胞较对照组染色加深、分裂细胞减少、不对称核分裂减少、细胞多形性减少;A2细胞较对照组体积增大、分裂细胞减少、梭形细胞增多、出现大量的多核巨细胞，集落化现象消失。经吖啶橙荧光染色观察，随药物作用时间增加，A549处理组出现凋亡细胞。经罗丹明123荧光染色观察，A549、A2处理组线粒体荧光减少、强度降低，部分荧光颗粒变粗大。药物作用后，A549、A2细胞在癌基因c-myc、抑癌基因Rb的表达上均与对照存在差异。c-myc的表达下降，A549细胞的Rb表达增高、A2细胞的Rb表达降低。经电子显微镜观察，处理组细胞线粒体肿胀、变圆、线粒体嵴模糊不清至线粒体空泡化改变、细胞表面绒毛脱落、核质浓缩、出现凋亡和破碎细胞;免疫组化、Western与Rt-PCR结果中，用以肿瘤分化程度比较的药物处理组中，A549细胞抑癌基因上调比例为60.0％(6/10)、癌基因下调比例为75.0％(6/8)，A2细胞抑癌基因上调比例为30.0％(3/10)、癌基因下调比例为100.0％(8/8)。 结论： 剂量效应关系、肿瘤分化程度、线粒体数量与功能、S期所占比例可对药物的作用效果产生影响。