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多氯联苯(PCBs)是一种严重的环境污染物，它不断威胁着自然生态系统和人类健康。微生物治理多氯联苯环境污染具有环境破坏小、经济有效，且不会产生二次污染等特点而被人们广泛关注。水解酶BphD作为PCBs微生物降解途径中的关键酶，其结构和功能已成为该领域研究的热点。 本文从一株联苯降解菌株Rhodococcus sp.R04的基因组中扩增水解酶基因bphD，并将其克隆到表达载体pBV220中，构建了重组质粒pBV220-bphD。表达产物经离子交换和凝胶排阻两步层析，最后获得了电泳纯的BphD，SDS-PAGE和分子排阻层析表明它是一个亚基分子量为31 kD的同源四聚体。在此基础上，对BphD的部分酶学性质以及其圆二色性进行初步研究，同时对几种金属离子、表面活性剂和抑制剂等因素对BphD的影响做了进一步的分析。结果显示BphD的最适反应温度和最适pH分别为80℃和9。该酶在60℃温浴1h，酶活剩余90％，而在70℃温浴时，半衰期为1h，是迄今为止在有关红球菌的报道中唯一一例热稳定性高的水解酶。BphD的圆二色谱在208 nm和222 nm为典型的双负峰，表明该酶是一个以α-helix占主导的蛋白，当温度升高到70℃时，其二级结构发生了明显的变化，80℃时BphD的结构已经遭到严重的破坏。1 mmol/L的金属离子除Mn2+对BphD的活性有微弱促进作用之外，其它的对其活性均有不同程度的抑制，SDS对BphD的抑制作用也较为强烈。另外，该酶的金属依赖性不强，但其抗氧化能力相对较强。 利用圆二色谱技术进一步探讨了BphD的热稳定性与其二级结构的关系，结果表明该酶活性的高低依赖于其二级结构的完整性。随着反应温度的不断升高，该酶的的二级结构逐渐遭到破坏，此时酶活性表现出逐渐下降的趋势。对几种同源水解酶的一级结构进行比对，发现Ser、His、Asp以及Trp在所有的水解酶中完全保守，另外还发现S46、G53、V65、A180、V207、S213和M252等位置的氨基酸与其它几种水解酶相同位置的氨基酸不同，是红球菌R04 BphD所特有的序列。对BphD这些保守氨基酸残基进行特异性地化学修饰，结果显示它们对酶活影响较大，推测它们很可能在催化过程中担任重要角色，或者位于酶的活性中心。为进一步确定BphD保守氨基酸及特有氨基酸的功能，分别对它们进行了定点突变和表达。 此外，对BphD的稳态和前稳态动力学进行初步研究。以HOPDA作为底物时，BphD的Km为0.44μmol/L，kcat为2.8 s-1。儿茶酚类的物质不能作为BphD的底物;联苯类物质中HOPDA是最适底物，且BphD对氯代HOPDA的降解受到氯原子取代数目的影响。利用停流光谱技术跟踪了BphD对底物HOPDA的水解历程。底物HOPDA在反应之初迅速地消耗，最终达到恒定水平;酶-底物复合物在反应初始阶段迅速地生成，然后又急速地分解，最后逐渐趋于平衡;产物HPD随着反应时间的延长逐渐增多，并达到一个平衡状态，此时酶促反应达到稳态水平，整个反应符合典型的酶促反应动力学;且反应温度和酶浓度的升高都会加速各反应元件达到稳态水平。这为进一步研究水解酶的动力学机制奠定了基础。