论文部分内容阅读
白鲟是一种罕见而具有特殊经济价值的鱼类，是世界上最大的淡水鱼，与长江白鳍豚、中华鲟同处濒危状态。白鲟分布狭窄，全世界只有我国才有，被誉为“长江中的活化石”，在国内分布于黄海、东海、长江、钱塘江等水域，有时进入支流或大型湖泊进行索饵洄游。目前白鲟群体已极度濒危，1988年被列为国家一级保护动物，1996年被列为IUCN红色目录下的极危物种，并被列入CITES附录II加以保护。对于白鲟这样极度濒危的物种，获取新鲜材料非常困难，本研究以中国科学院水生生物研究所标本馆保存的福尔马林固定白鲟标本(共11尾)为研究材料，从这些福尔马林固定标本组织中提取DNA片段，并应用微卫星分子标记开展白鲟保护的分子生态学研究，进一步了解这一物种的遗传学特征。福尔马林足种最常用的标本固定剂，其优点在于渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快，并能快速杀死生物细胞以固定生物大分子。但福尔马林固定标本的DNA难于提取，产量低，所得的DNA片段化，难以进行PCR扩增等。针对以E情况，本研究通过一系列优化对比实验最终实现了福尔马林固定白鲟标本DNA的稳定提取，并通过相近种引物对白鲟基因组DNA进行了扩增。主要研究结论如下：
⑴按照DNA常规提取方法如常规消化、酚十氯仿异戊醇抽提、无水乙醇沉淀后无法得到可见DNA。
⑵对标本进行预处理比较：包括双蒸水或PBS冲洗、将组织长时间浸泡于20倍体积的TE9.0中(12-48小时或更长)直接处理和酒精梯度离心法(按照30％-50％-70％-80％-90％100％梯度)处理，其中TE9.0的长时间浸泡后结合酒精梯度离心法预处理能够比较彻底地去除掉甲醛成分。
⑶消化条件对比：在肝脏、心脏、肌肉和鳍条等组织的提取过程中证明了肌肉组织作为消化材料最为理想；组织颗粒越小越好，采用组织匀浆器匀浆后消化比较彻底；提高消化液中TE浓度、PH值以及蛋白酶K、SDS的浓度并延长消化时间(48-72h)能够使得标本组织更容易被消化，并能更好的保护DNA。
⑷抽提方法比较：氯仿-异戊醇+饱和Nacl溶液抽提对比直接饱和Nacl溶液(6mol/L)盐析法抽提，由于DNA和蛋白质的交联使得前者在去除蛋白质的过程中顺带造成大量DNA的损失，结果是直接盐析法得到的基因组DNA的量要远远多于前者，而且简单、费用低、时间耗费短。
⑸沉淀DNA选用异丙醇取代无水乙醇，-20℃沉淀持续时间延长为10小时以上，因为异丙醇的沉淀能力要高于无水乙醇，长时间沉淀DNA效果会更彻底。离心后的异丙醇继续离心仍可以得到相当量的基因组DNA，前三次离心效果比较明显。
⑹试剂盒法分组对比：酒精梯度法预处理十试剂盒提取几乎无法得到可见DNA；直接用试剂盒提取仅能得到一尾样本的基因组DNA，结果差异比较显著，效果不稳定，此法对于不同年代或者不同的组织并不普遍适用。
⑺相近种微卫星引物的跨种跨属、科扩增：8对匙吻鲟微卫星引物和1对中华鲟引物对从福尔马林固定白鲟组织中提取到的基因组DNA进行扩增，无法得到明显扩增条带。可能由于引物跨度大的局限性，也可能是提取到的DNA中含有很多PCR抑制因子。
⑻由于从福尔马林固定标本中提取到的基因组DNA的量很少，加上含有一些复杂成分比如金属离子等，在分光光度计下读数会出现偏差，导致结果不准确。
⑼本实验11尾个体固定时间不同(1974-1988)，但所得到的DNA条带并无多大差异，从而验证了标本保存时间的长短并不影响DNA分子的大小，而主要与保存液是否被暴露于空气中发生氧化有关。