果蝇抗菌肽diptericin的克隆及在毕赤酵母中的表达

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抗菌肽对许多致病菌,如致病型大肠杆菌、伤寒杆菌、硝酸盐杆菌等有抗菌作用。而且,部分抗菌肽对一些临床耐药致病菌也有良好的抗菌作用。人类真菌病害在目前仍是一个难以解决的问题。抗真菌肽的发现,无疑为该类病害的治疗提供了新的思路。传统抗生素的毒副作用及其耐药菌株的出现,迫使人们去寻找新型的抗微生物制剂。研究发现双翅肽(diptericin)能够快速的杀死广谱病原微生物,且作用机理特殊,相对地不具有免疫原性,展示了其在应用方面的广阔前景。 本研究根据GenBank中提交的序列,以果蝇总DNA为模板,利用PCR技术,扩增出两端加入了连接接头的diptericin基因,将接头处理成粘性末端,与经过CpoⅠ及NotⅠ酶切后的pHBM905B表达载体正确连接。将diptericin基因与分泌型酵母表达载体pHBM905B重组,构建重组酵母表达载体pHBM905B/diptericin,经“三明治”夹心平板筛选及菌落PCR鉴定证明目的基因已整合入酵母染色体中。挑选阳性克隆用甲醇诱导其表达,以SDS-PAGE电泳分析表达产物,表达蛋白的相对分子量约为9KD左右,与预期分子量大小一致。用琼脂孔穴扩散法检测上清液的生物学活性,观察到产生了明显的抑菌圈,显示其具有较强的抗菌活性,并且表达产物有极强的热稳定性,展示了诱人的应用前景,为以后进一步的药学分析研究及工业批量生产奠定了基础。
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