论文部分内容阅读
第一部分miRNA参与百草枯和MPTP致神经细胞损害的作用研究目的探讨百草枯(PQ)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)致小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a)损害时microRNA(miRNA)表达谱的变化情况，并比较这两种神经毒物所致miRNA表达谱改变模式。方法(1)0、100、300μ M PQ分别处理Neuro-2a细胞12、24、48h，Hoechst-33258染料法(n=5)和Annexin V-FITC/PI流式细胞仪(n=3)测定细胞凋亡；0、300μ M MPTP处理Neuro-2a细胞48h (n=3)，Annexin V-FITC/PI流式细胞仪测定细胞凋亡；(2)0、300μ M PQ和300μ M MPTP处理Neuro-2a细胞48h (n=3)后，进行miRNA芯片检测，分析miRNA表达谱的变化，并通过火山图(Volcano Plot)过滤，确定差异表达的miRNA(差异倍数(FC)≥1.5，p<0.05)；(3)挑选出6个差异表达的miRNAs (miR-17-5p、miR-93-5p、miR-210-3p、 miR-374-5p、 miR-378-3p、 miR-503-5p)，用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证其表达水平；(4)用Microcosm、 Targetscan和Miranda预测miRNA潜在靶基因；对特异的miRNA下游靶基因进行基因本体(GO)分析和KEGG通路分析。结果(1)PQ可诱导Neuro-2a细胞凋亡和死亡，且存在时间-剂量效应和浓度-剂量效应，时间和浓度之间存在交互作用；MPTP也可诱导Neuro-2a细胞凋亡和死亡；(2)300μ M PQ和300μ M MPTP处理细胞48h，均可引起miRNA表达谱的改变；与对照组比较，PQ组60个miRNAs表达上调,228个表达下调；MPTP组506个表达上调,70个表达下调；(3)qRT-PCR验证miRNAs的表达水平的结果表明：与对照组比较，PQ组miR-374-5p和miR-503-5p表达下调，差异有统计学意义(p<0.05)；MPTP组miR-93-5p表达上调，差异无统计学意义(p>0.05)；与PQ组比较，MPTP组miR-17-5p和miR-378-3p表达上调，差异有统计学意义(p<0.05)，miR-93-5p和miR-210-3p表达上调，差异无统计学意义(p>0.05)；其结果与芯片结果大体致。(4)联合应用靶基因预测程序预测到362个共同靶基因，基因本体(GO)分析结果表明：miR-17-5p和miR-93-5p共同参与DNA依赖的转录调控、RNA代谢过程和分子功能的调节，miR-17-5p还参与细胞内信号级联、嘌呤核苷酸的结合过程，miR-93-5p还参与磷代谢、转录调节子的活性过程；KEGG pathway分析结果表明：miR-17-5p和miR-93-5p共同参与内吞作用、细胞周期通路， miR-17-5p还参与MAPK信号通路、泛素介导的蛋白质水解，miR-93-5p还参与膀胱癌、TGF-β信号通路、p53信号通路。总之，这些结果共同提示miRNA可能参与PQ诱导和MPTP诱导的神经细胞退行性病变过程。结论PQ和MPTP致神经细胞损害时均出现miRNA表达谱的特征性改变，miRNA可能参与PQ和MPTP致神经细胞退行性病变的分子机制。第二部分反式转录因子Nrf2参与百草枯和MPTP致神经细胞损害的作用目的建立PQ或MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)ICR小鼠PD模型，进步探讨Nrf2参与百草枯和MPTP致神经细胞损害的作用。方法(1)5、10mg/kg PQ和30mg/kg MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠；(2)HE染色法检测中脑黑质细胞形态学改变(n=3)，每组三片；(3)酪氨酸羟化酶TH免疫组化染色法检测中脑黑质多巴胺能神经元数量变化情况(n=3)，每组三片；(4)原位缺口末端标记TUNEL检测中脑黑质细胞凋亡情况(n=3)，每组三片；(5)Nrf2免疫组化染色法检测中脑黑质Nrf2蛋白表达情况(n=3)，每组三片。结果(1)PQ、MPTP染毒小鼠后出现类PD样行为异常，Nrf2(-/-)小鼠表现更为明显。(2)与生理盐水对照组相比，30mg/kg MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠神经细胞出现明显的细胞核固缩、碎裂、呈蓝黑色，未见其他明显变化；5、10mg/kg PQ染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠细胞同样出现明显的细胞核固缩、碎裂，呈蓝黑色，未见其他明显变化。(3)与生理盐水对照组比较，MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠的中脑黑质TH蛋白免疫反应阳性的DA神经元数量减少，差异有统计学意义(p<0.01)。5mg/kg PQ染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠TH蛋白免疫反应阳性的DA神经元未见明显变化，差异无统计学意义(p>0.05)。10mg/kg PQ染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠TH蛋白免疫反应阳性的DA神经元数量减少，差异有统计学意义(p<0.01)。(4)与生理盐水对照组相比，30mg/kg MPTP染毒后，Nrf2(+/+)ICR和Nrf2(-/-)小鼠中脑黒质神经细胞均见凋亡；虽然5mg/kg PQ染毒后，Nrf2(+/+)ICR和Nrf2(-/-)小鼠中脑黒质神经细胞未见明显凋亡，但10mg/kg PQ染毒后，Nrf2(+/+)ICR和Nrf2(-/-)小鼠中脑黒质神经细胞均见凋亡。(5)生理盐水处理Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠中脑黑质，细胞形态、细胞凋亡率未见差异，TH蛋白免疫反应阳性的DA神经元数量差异无统计学意义(p>0.05)；5mg/kg PQ染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠中脑黑质细胞核出现核固缩、碎裂、呈蓝黑色，细胞均未见凋亡；TH蛋白免疫反应阳性的DA神经元蛋白数量差异无统计学意义(p>0.05)；10mg/kg PQ染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠中脑黑质细胞核出现核固缩、碎裂、呈蓝黑色，可见较明显的细胞凋亡；10mg/kg PQ染毒Nrf2(-/-)小鼠TH蛋白免疫反应阳性的DA神经元数量与Nrf2(+/+)小鼠相比有所减少，差异有统计学意义(p<0.05)；30mg/kg MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠中脑黑质均出现核固缩、碎裂、呈蓝黑色，可见较明显的细胞凋亡；Nrf2(-/-)小鼠比Nrf2(+/+)小鼠TH蛋白免疫反应阳性的DA神经元表达上升，差异有统计学意义(p<0.05)。(6)生理盐水处理Nrf2(-/-)小鼠与Nrf2(+/+)小鼠后，与Nrf2(+/+)小鼠对比，Nrf2(-/-)小鼠Nrf2表达量明显降低，基本上不表达。(7)与生理盐水Nrf2(+/+)ICR小鼠组比较，30mg/kg MPTP染毒组Nrf2蛋白表达下降；5mg/kg PQ染毒组也下降，但10mg/kg PQ染毒组有所增加。结论成功建立PQ或MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠PD模型；Nrf2在PQ诱导的神经毒性中起神经保护作用。第三部分反式转录因子Nrf2在百草枯、MPTP致小鼠中脑黑质microRNA表达改变中的作用目的探讨百草枯(PQ)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)致小鼠中脑黒质损害时microRNA(miRNA)表达谱的变化情况，并比较这两种神经毒物所致miRNA表达谱改变模式；应用Nrf2基因敲除小鼠探讨反式转录因子Nrf2在百草枯、MPTP致小鼠中脑黑质microRNA表达改变中的可能作用。方法(1)生理盐水，5、10mg/kg PQ和30mg/kg MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠(n=3)；(2)生理盐水，5、10mg/kg PQ和30mg/kg MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠后，取中脑黒质进行miRNA(n=3)和mRNA(n=3)芯片检测，分析miRNA和mRNA表达谱的变化，并通过火山图(Volcano Plot)过滤，确定差异表达的miRNA(差异倍数(FC)≥1.5且p<0.05)，mRNA(差异倍数(FC)≥2且p<0.05)；(3)用锁定核苷酸原位杂交(LNA-ISH)和qRT-PCR验证验证miRNA-380-3p表达水平(n=3)；(4)用Microcosm、Targetscan和Miranda预测miRNA-380-3p潜在靶基因，(5)预测到的潜在靶基因结果与mRNA芯片检测结果比对分析，确认潜在的可能下游靶基因。结果(1)Nrf2依赖效应(非依赖于MPTP、PQ处理)：miR-128、miR-7a、miR-669c、miR-298、miR-543、miR-770-5p、miR-669b*、miR-544-5p与Nrf2相关。(2)PQ或MPTP处理Nrf2(+/+) ICR小鼠中脑黒质miRNA表达谱出现改变，miR-140和miR-380-3p可能参与PQ或MPTP引起的神经毒性。(3)PQ或MPTP处理Nrf2(-/-)ICR小鼠miR-135b均出现改变，不同剂量PQ处理Nrf2(-/-)ICR小鼠后miR-142-5p和miR-451均出现改变。(4)MPTP依赖效应(非依赖于Nrf2)：MPTP可引起miR-674-3p、miR-133b、miR-135b、miR-380-3p的改变。(5)低剂量PQ依赖效应(非依赖于Nrf2)：5mg/Kg PQ可引起miR-140表达的改变。(6)高剂量PQ依赖效应(非依赖于Nrf2)：未见相关miRNAs改变。(7)Nrf2-MPTP相互作用的效应(依赖于Nrf2和MPTP)：miR-543、miR-379、miR-376c*、 miR-380-3p、 miR-467g、 miR-669c*、 miR-1902、 let-7d*、miR-669f-3p、 miR-351、miR-615-3p、 miR-138-1*、miR-378/miR-378b、miR-99b*、miR-34b-3p。(8)Nrf2-低剂量PQ相互作用的效应(依赖于Nrf2和低剂量PQ): miR-31、miR-376c、let-7i*、miR-669b*、miR-377、miR-382、miR-338-5p、miR-135a、miR-344、miR-219-3p、miR-700*、miR-15b、miR-3099、miR-301a。(9)Nrf2-高剂量PQ相互作用的效应(依赖于Nrf2和高剂量PQ):miR-495*、miR-154*、let-7b、miR-1983、miR-26a。(11)不同处理后共同差异表达的miRNAs有miR-376c、miR-154*、miR-377。(12)锁定核苷酸原位杂交验证PQ或MPTP处理Nrf2(+/+)ICR和Nrf2(-/-)ICR小鼠后miR-380-3p表达情况，结果与表达谱致。同样qRT-PCR验证结果也与表达谱致。(13)靶基因预测结果与mRNA表达谱结果共同提示Sp3mRNA可能是miRNA-380-3p的下游靶基因。miR-128、miR-7a、miR-669c、miR-298、miR-543、miR-770-5p、miR-669b*、miR-544-5p与Nrf2相关。结论PQ、MPTP体内暴露可改变miRNA表达谱，这可能是PQ、MPTP神经毒性作用机制之，两者引起的miRNA表达谱改变既有差异也有相关；MPTP可能是通过其与反式作用因子Nrf2之间相互作用引起中脑黒质miRNA表达谱改变，其中miR-380-3p/Sp3mRNA的途径改变是其中结果之，这很可能是MPTP诱导神经毒性的机制之；PQ可能是通过其与反式作用因子Nrf2之间相互作用引起中脑黒质miRNA表达谱改变，这种改变依PQ剂量不同而所不同，高剂量PQ的神经毒性中miR-495*、miR-154*、let-7b、miR-1983、miR-26a可能起作用；低剂量PQ的神经毒性中主要是miR-669b*在起作用。