PRRSV N基因原核双基因表达载体与毕赤酵母表达载体的构建及其表达研究

• 作 者: 钱洪喜
• 机 构: 四川农业大学
• 发表日期: 0年期
• 关键词: PRRSV N基因 基因表达载体 毕赤酵母表达载体 双基因融合 PRRS防控 PCR鉴定

本研究以RT-PCR分别扩增了PRRSV美洲型N基因(以NA表示)和欧洲型N基因(以NE表示)，并开展了以下两方面的研究：(1)将NA和NE基因片段同时插入pET-32a(+)中构建了双基因融合表达载体pET-32a(+)-NA-NE，并进行了表达研究：(2)将NA和NE基因片段分别插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中构建了pPIC9K-NA和pPIC9K-NE，并进行了表达研究。本研究为深入研究N蛋白的结构与功能、制备诊断试剂及开展分型诊断等奠定了基础，对PRRS的防控具有重要的意义。
1.双基因融合表达载体pET-32a(+)-NA-NE的构建及其表达研究
针对美洲型和欧洲型PRRSVN基因设计两对特异性引物，以RT-PCR扩增获得NA和NE基因，分别插入pMD19-Tsimple载体中，构建了pMD19-T-NA和pMD19-T-NE，并对两重组质粒进行了测序鉴定。将pMD19-T-NA和pET-32a(+)经NcoI&EcoRI双酶切后连接构建了pET-32a(+)-NA重组质粒；再将pET-32a(+)-NA和pMD19-T-NE经EcoRI&NotI双酶切后连接构建了双基因融合表达载体pET-32a(+)-NA-NE。pET-32a(+)-NA-NE经PCR和不同双酶切鉴定均得到预期大小的片段，结果表明成功构建了双基因融合表达载体pET-32a(+)-NA-NE。将pET-32a(+)-NA-NE转化大肠杆菌BL21进行了表达，IPTG最佳诱导浓度为1.0mM/L，最佳诱导时间为3h；经SDS-PAGE分析表达的融合N蛋白(NA-NE蛋白)大小约为49kD；经Westernblotting表明，该融合N蛋白具有良好的反应原性。
2.毕赤酵母表达载体pPIC9K-NA和pPIC9K-NE的构建及其表达研究
针对NA基因重新设计一对引物(只更换酶切位点)扩增获得了NA基因，插入pMDl9-Tsimple载体中构建了pMD19-T-NA1。将pMD19-T-NA1和pMD19-T-NE经EcoRI&NotI双酶切后回收NA和NE基因片段，分别插入经EcoRI&NotI双酶切处理的pPIC9K中构建了毕赤酵母表达载体pPIC9K-NA和pPIC9K-NE，并分别对两种重组质粒进行了PCR和双酶切鉴定。pPIC9K-NA和pPIC9K-NE经PCR鉴定和不同双酶切鉴定均得到预期大小的片段，结果表明成功构建pPIC9K-NA和pPIC9K-NE。将pPIC9K-NA和pPIC9K-NE经SacI线性化后分别电转化毕赤酵母宿主菌GS115，再经G-418/YPD筛选获得高拷贝数重组子；重组子经表型鉴定为Mut+，且PCR鉴定为阳性。阳性重组子经甲醇诱导表达，在96h表达产物量最大，SDS-PAGE显示表达产物大小均约为15kD，Dotblotting表明表达的两型N蛋白均能与相应型阳性血清发生反应，具有良好的反应原性。