论文部分内容阅读
研究目的:高血压心肌肥大由于压力负荷、血管紧张素II(Angiotensin II,AngⅡ)引起的疾病,它促进心血管发生的概率增加2-4倍,如不及时干预与治疗,任其发展就会发生心衰、心肌梗死等心脏疾病,严重威胁人类健康。低氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1α,HIF-1α)在缺氧的条件下,表达量增多、稳定性增强。HIF-1α进入细胞核与HIF-1β形成稳定的二聚体促进相关基因的表达。HIF-1α可以通过调节血管的生成和重塑来调节缺氧条件下的氧气运输,敲除HIF-1α的大鼠表现出毛细血管的生成量减少、心肌代谢异常等现象。在患有缺血性心肌病患者的心脏中,HIF-1α的表达量升高。有研究表明,除缺氧诱导HIF-1α表达增加外,AngⅡ也可以诱导其表达量的增加。AngⅡ诱导心肌发生肥大时转录生长因子β-活化激酶1(The Transforming-growth-factor-β-activated Kinase,TAK1)的表达量也增加。TAK1作为心肌肥大的重要调节因子,对心肌肥大的发生发展具有重要作用。TAK1基因在大鼠体内发生突变时会导致血管扩张、血管平滑肌缺乏等现象,在患者体内发生突变会表现为心脏畸形综合征。在AngⅡ或压力负荷状态下,TAK1的表达量增加,磷酸化、泛素化增强,活化的TAK1级联激活下游信号通路,促进肥大相关因子的表达。HIF-1α与TAK1在病理性心肌肥大发生时各自发挥着重要作用,但他们在病理性心肌肥大中相互关系尚未明确。针对这一问题,我们对HIF-1α与TAK1在病理性心肌肥大中相互之间的关系进行探究。材料方法:从尸检标本中搜集心肌肥大患者心肌组织;构建心肌肥大大鼠模型,制备心脏组织切片。采用苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosin Staining,HE)确定心脏组织是否发生肥大,免疫组化检测确定当心肌肥大发生时HIF-1α与TAK1的表达。人源心肌细胞系:AC16细胞,用携带sh HIF-1α质粒慢病毒和过表达HIF-1α质粒慢病毒分别转染AC16细胞,筛选稳定表达细胞株;再分别将插入不同序列的TAK1启动子的荧光素酶报告基因质粒共转染至不同的细胞中,给予AngⅡ刺激0或24h,收集样品。采用Western Blot检测心房利钠肽(AtrialNatriuretic Peptide,ANP)、HIF-1α、TAK1蛋白水平的表达,采用荧光素酶报告基因、染色质免疫共沉淀检验HIF-1α与TAK1启动子结合情况。实验结果:无论是心肌肥大患者的心肌组织还是由AngⅡ诱导的大鼠心肌组织,心肌细胞发生肥大,且HIF-1α与TAK1的表达量同时升高。在体外,用不同浓度AngⅡ(0μM、0.1μM、1μM)刺激AC16细胞24h,ANP蛋白的表达量随AngⅡ浓度的增高而升高,HIF-1α、TAK1也随之升高。用不同浓度AngⅡ(0μM、1μM)刺激感染了sh HIF-1α慢病毒的心肌细胞24h,HIF-1α的表达量明显抑制,ANP蛋白的表达量降低,TAK1蛋白表达量也降低。将不同TAK1启动子序列以及突变序列插入荧光素酶报告基因质粒共转染至AC16细胞中,给予AngⅡ刺激0或24h。给予AngⅡ刺激24h的细胞中HIF-1α的蛋白表达量升高,插入TAK1启动子的全部序列、-2000～-1000bp和-1285～-1274bp的AC16细胞中,TAK1启动子活性增强。将-2000～-1000bp和-1285～-1274bp TAK1启动子序列插入荧光素酶报告基因质粒共转染至sh RNA-HIF-1α细胞中,HIF-1α的表达量降低,TAK1启动子活性减弱。将-2000～-1000bp和-1285～-1274bp序列插入荧光素酶报告基因质粒共转染至p CDNA-HIF-1α细胞中,HIF-1α的表达量升高,TAK1启动子活性增强。在AC16细胞中,给予AngⅡ刺激24h后,HIF-1α与TAK1的DNA序列结合量较多。在p CDNA-HIF-1α细胞中,HIF-1α与TAK1的DNA序列结合量增多。实验结论:1.在患有心肌肥大的患者心脏中,HIF-1α与TAK1蛋白表达量同时升高。2.由AngⅡ诱导大鼠或AC16细胞均能发生心肌细胞肥大,HIF-1α与TAK1蛋白表达量都同时升高。3.HIF-1α是TAK1的转录因子,与TAK1启动子-1285～-1274bp结合,促进TAK1的表达进而促进心肌肥大的发生。