猪瘟兔化弱毒编码E2囊膜糖蛋白A/D抗原区基因的原核表达和重组蛋白的初步应用

• 作 者: 苏小运
• 机 构: 南京农业大学
• 出 处: 南京农业大学
• 发表日期: 2003年期
• 关键词: 猪瘟兔化弱毒 原核表达 E2 A/D抗原区 间接ELISA

本文利用不同大肠杆菌表达系统(所用表达载体分别为：pThioHisB和pET-32a(+))表达了猪瘟兔化弱毒编码E2蛋白A／D抗原区的基因，并对其表达特性进行了比较。选取含pET-E2HA重组质粒的BL21(DE3)，即BL21E2HA大量表达重组蛋白，通过盐酸胍溶解，通过His Bind柱纯化了重组蛋白，定量并以其为包被抗原建立了间接ELISA方法。利用此方法测定了约150份囊素与猪瘟兔化弱毒疫苗共同免疫猪血清的猪瘟抗体水平；比较了此方法和间接血凝试剂盒测定猪瘟抗体水平的灵敏度。主要实验内容包括： 1．构建了两株重组质粒：pTH-E2和pET-E2，所用表达系统分别为pThioHisB和pET-32a(+)，优化了表达条件并比较了两种质粒的表达特性，发现pET系统在表达此段基因时产量明显优于pThioHisB系统； 2．选择pET-E2进行后继工作：将3个串联的HA(人血凝素表位)基因插入到pET-E2重组质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点之间，得到pET-E2HA重组质粒，含有此质粒的BL21(DE3)命名为BL21E2HA，并将其成功的表达； 3．利用BL21E2HA大量表达重组蛋白，将细菌裂解，超声波破碎、离心分离包涵体，盐酸胍溶解后过His Bind柱，纯化了重组蛋白； 4．利用BSA制备标准曲线，并对处于不可溶状态的纯化后重组蛋白进行了定量。在此基础上，用其作包被抗原建立了间接ELISA方法；利用此间接ELISA方法，测定了约150份囊素与猪瘟兔化弱毒疫苗共同免疫猪血清的猪瘟抗体水平，发现经囊素共同免疫后，猪瘟抗体水平有明显提高，这从另一方面证明，该方法具有一定的实用价值，可以进行猪瘟抗体水平的测定； 5．比较了间接ELISA方法和现有的间接血凝试剂盒测定猪瘟抗体水平时的灵敏度，发现该方法明显优于后者。 6．构建了一个用以检测在细胞培养上猪瘟病毒粒子存在的重组质粒。