【摘 要】
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胸膜肺炎放线杆菌是猪传染性胸膜肺炎的病原体,该病对全球养猪业经济发展来说是一个重要疾病.对于该病的诊断一直是困扰该病预防控制的瓶颈.目前,胸膜肺炎放线杆菌已发现了至
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胸膜肺炎放线杆菌是猪传染性胸膜肺炎的病原体,该病对全球养猪业经济发展来说是一个重要疾病.对于该病的诊断一直是困扰该病预防控制的瓶颈.目前,胸膜肺炎放线杆菌已发现了至少15种血清型,它们表达三种不同的细胞毒素蛋白APX Ⅰ、APXⅡ和APXⅢ.近年来,在胸膜肺炎放线杆菌中发现了第四种RTX因子,其被命名为ApxⅣ.与APX Ⅰ,APXⅡ,APXⅢ不同的是,ApxⅣ毒素在15种血清型中都能分泌产生.apxⅣ基因的表达产物在胸膜肺炎放线杆菌体外不同培养条件下不能被检测到.但是,实验已证明apxⅣ基因产物在体内能被诱导产生的.apxⅣ基因有种属特异性,只存在于所有猪胸膜肺炎放线杆菌的15中血清型中.核酸探针试验已表明,其它放线菌属,如rossii放线菌,suis放线菌,以及临床上症状相似的菌属都无法检测到apxⅣ基因.另外,APX Ⅰ,APXⅡ,APXⅢ的抗体无法和ApxⅣ发生血清学反应.反之,ApxⅣ的抗体也无法和APX Ⅰ,APXⅡ,APXⅢ发生血清学反应.该实验根据ApxⅣA的以上特性,结合对apxⅣ基因结构特征的分析,选取了apxⅣA3末端更为特异的492bp的碱基片断进行了扩增.以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板克隆,鉴定,扩增出ApxⅣA 3末端特异蛋白片段,序列分析结果表明,其与基因库标准7型之间的同源性为97％.以该基因构建了表达载体pGEX-ApxⅣA,转入感受态细胞BL21中,以IPTG(1mM)诱导5小时高效表达出了融合蛋白GST-ApxⅣA,经蛋白胶薄层扫描分析其表达量达16%,检测已表明融合蛋白GST-ApxⅣA有良好的活性.以此融合蛋白为包被抗原初步确定了包被浓度,包被条件,血清稀释倍数,初步建立了间接ELISA诊断方法,实验证明检出率达85.7%.该诊断方法可迅速检测出感染猪传染性胸膜肺炎,而对灭活苗免疫猪血清不产生反应,并且可以不与临床上症状、病理变化相似于胸膜肺炎放线杆菌的菌属血清发生血清学反应.ApxⅣA毒素特异片段的成功表达蛋白为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础,大大提高了海关,大型猪场等的检疫速度和准确性.
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