桑枯萎病病原细菌的分离、鉴定及分子检测方法的建立

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近年来,浙江,广东等桑树主栽区相继发生一种类似于桑青枯病的新型病害,对蚕桑业生产造成了严重的损失。本研究通过对引发桑细菌性枯萎病病原的分离,鉴定和分子检测进行探讨。为国内由肠杆菌属导致桑树枯萎病提供了又一证据。通过从发病植株根部木质部进行病原分离,科赫氏法则验证及生化和分子鉴定,证明导致该病害发生的病原为肠杆菌属Enterobacter sp.。同时,针对分离到的4株典型菌株rpoB基因设计了特异性的引物,并对该病病原进行了检测。取得了以下主要成果:1)通过在广东省广州市罗岗等地进行采样,对新发病桑树植株根部木质部进行病原分离,得到病原菌40株。采用4种接种方法对4株典型代表菌株的致病性测试表明,伤根接种法最为有效,并采用伤根接种法进行科赫氏法则验证。结果表明:测试的四株典型菌株均能使桑苗叶片黄化、落叶和顶端坏死,引起桑苗枯萎和维管束变褐,并能重新分离出相同病原,接种后产生相同症状。为了探明广州地区桑枯萎病的真正病原,通过对4株代表菌的常规细菌学、光学显微镜和透射电镜观察、形态学、生理生化鉴定及分子鉴定,表明这4个菌株为革兰氏阴性,短杆状细菌,确认“桑枯萎”病为肠杆菌属(Enterobacter spp.)所引起。“桑枯萎”病是一种仅浙江省报道过的桑树新病害,是Enterobacter sp.引起植物病害的又一新证据。一直以来广州桑树维管束病原菌都被认为是桑青枯菌,本研究结果对认清广州桑树病害具有重要的指导意义。2)利用rpoB基因序列设计并合成了两对桑细菌性枯萎病病原的引物,通过Semi-nested PCR进行桑枯萎病的分子检测,结果发现4株桑树细菌性枯萎病病原菌、1株桑疫病病原细菌、1株桑青枯病病原细菌,12株桑腐生(附生)菌株及4株肠杆菌标准菌株经检测后其特异性达到了预期的要求;无论是纯化的菌株DNA还是桑树表现或未表现症状的样本粗悬液均能扩增出167bp左右大小片段。因此无需经菌株的纯化,桑树样本制成的细菌粗悬液即可直接应用于PCR检测。同时对桑枯萎病菌和田间采集样本的进行灵敏性检测,发现DNA稀释至10-3仍能检测到,菌体稀释到10-4时能检测到,而10-5、10-6则不能检测到。
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