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目的:
1、通过乳腺肿瘤患者组织以及血液中线粒体DNA(mtDNA)4977 bp大片段缺失检出的研究,探究mtDNA4977 bp大片段缺失与乳腺肿瘤的关系,以期探究mtDNA4977 bp缺失做为肿瘤的分子信标可能性。
2、通过研究检出mtDNA4977 bp大片段缺失病人的缺失水平与mtDNA拷贝数改变的关系,来探究缺失以及拷贝数变化在乳腺肿瘤发生中的作用。
方法:
1、根据病理论断结果选取113例乳腺癌患者以及118例乳腺良性肿瘤患者做为其对照,收集病人的冰冻切片以及血液并采集所有患者的临床资料。
2、通过手工法提取患者的冰冻切片组织以及血液总DNA采用巢式PCR来扩增缺失并通过琼脂糖凝胶电泳来检测缺失有无。
3、通过T载体与纯化的含有目的片段的PCR产物连接构建标准质粒,蓝白斑筛选,酶切并测序验证后提取质粒DNA测定OD值,计算拷贝数并做梯度浓度稀释制成标准品。
4、采用TaqMan探针法对肿瘤的血液以及组织标本进行实时荧光定量PCR的方法检测mtDNA4977 bp缺失水平及拷贝数变化。
5、采用SPSS16.0软件对肿瘤患者各项临床资料进行处理分析,得到mtDNA4977 bp缺失与各临床资料的关系。
结果:
1、在113例乳腺癌患者(6例无血液)的血液、癌旁正常组织以及癌组织中分别检测到51、48及56例mtDNA4977 bp缺失,缺失检出率分别为47.66％、42.48％及49.56％。
2、在118例乳腺良性肿瘤患者的血液及组织中分别检测到12例及51例mtDNA4977 bp缺失,缺失检出率分别为10.17％及43.22％。
3、血液中mtDNA4977 bp的缺失水平最低值为3.47x10-6最高值为2.152x10-3；组织中缺失水平最低值为3.40x10-6,最高值为1.126x10-2,肿瘤患者血液中缺失的水平随年龄增加有下降的趋势,而组织中则呈上升趋势。
4、肿瘤患者血液以及癌组织mtDNA拷贝数随mtDNA4977 bp缺失增加而呈下降趋势,而良性肿瘤组织以及癌旁正常组织的mtDNA拷贝数随mtDNA4977bp缺失的增加呈上升趋势。
结论:
1、良性肿瘤血液与乳腺癌血液、良性肿瘤的血液与组织间mtDNA4977 bp缺失的检出比例存在着显著性的差异,而乳腺癌血液与其各组织,肿瘤良性组织与乳腺癌各组织之间缺失检出无显著性的差异。
2、在乳腺良性肿瘤血液标本中mtDNA4977 bp缺失与生育与否有关,未生育者发生mtDNA4977 bp缺失的概率要高于生育一个子女的(p=0.036),未生育者发生mtDNA4977 bp缺失的概率同样高于生育2个及以上的(p=0.028)。而在乳腺癌癌组织中,mtDNA4977 bp缺失与BMI大小、P53(+/-)以及Bcl-2(十/-)有显著性关系。
3、不同标本的mtDNA4977 bp缺失的水平不同,乳腺癌血液与乳腺良性肿瘤血液、乳腺癌患者癌组织与癌旁正常以及血液、良性肿瘤组织与乳腺癌癌旁正常组织均存在显著性差异。整体来说mtDNA4977 bp缺失水平由低到高依次为:良性血液<良性组织(癌组织)<乳腺癌血液<癌旁正常组织。线粒体DNA4977 bp的缺失检出率及缺失水平在乳腺癌血液中均显著性的高于乳腺良性肿瘤,可能成为潜在的肿瘤诊断的分子依据。