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背景与目的: 磁共振成像（MRI）因其组织分辨率高、软组织对比度良好、无X线辐射损伤等优点已成为移植干细胞的一种主要监测方法。目前，利用MRI对移植细胞的示踪主要有两种方法，即磁标记直接成像和报告基因间接成像，其中磁标记法的主要缺陷在于细胞内标记物会随着细胞的分裂增殖而不断降解，不能有效地对移植细胞实施长期示踪，而MRI报告基因成像将报告基因整合到标记细胞基因组中，通过基因在细胞内持续稳定表达，从而实现MRI对移植细胞的纵向连续示踪，有效地克服了磁标记成像的局限性。在众多MRI报告基因中，铁蛋白基因已成为研究热点。铁蛋白是一种内源性储铁蛋白，分为蛋白壳和铁核两部分。蛋白壳由重链（H）和轻链（L）两种亚基构建而成，其重链多肽1(FTH1）具有亚铁氧化酶的活性，具有诱导转铁蛋白受体的表达并促进铁吸收的能力，能引起MRI信号的改变，目前作为一种功能性磁共振报告基因已成为分子影像学研究的热点。 迄今，已有较多研究利用 FTH1报告基因 MR成像实现了对多种细胞的连续示踪。在我们的前期研究中，利用慢病毒载体将 FTH1报告基因转入骨髓间充质干细胞（MSCs）中，并将转基因的MSCs诱导分化为神经元样细胞，发现虽然诱导后的细胞形态和特异性标志物发生了变化，但细胞内FTH1表达量与诱导前无明显差异，且MRI信号降低程度较分化前也无显著变化。此结果说明仅利用MRI报告基因成像无法区分 MSCs分化前后两种状态，即不能判断干细胞分化事件的发生。解决这一问题的关键在于找到一种在神经组织细胞中特异性高表达的基因，利用该基因作为启动子驱动MRI报告基因表达，理论上可实现通过MRI报告基因成像监测干细胞成神经分化。本研究通过构建神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子驱动 FTH1基因表达的慢病毒（NSE-FTH1）并转染MSCs，并将转基因MSCs诱导分化为神经元样细胞，检测神经元样细胞中FTH1的表达及MRI信号改变情况，探讨NSE启动子驱动FTH1基因表达并利用MR成像监测MSCs成神经分化的可行性，为进一步实现利用MRI报告基因成像活体监测干细胞成神经分化奠定基础。 方法: 1 NSE启动子控制FTH1基因表达的慢病毒载体构建及病毒包装 人工合成NSE启动子cDNA序列，并与FTH1基因序列连接，将PCR产物和载体LV5进行酶切、连接、转化，获得重组慢病毒载体质粒LV5-NSE-FTH1-GFP-Puro.通过鉴定后转染293T细胞，48h后浓缩并收集这些病毒，命名为NSE-FTH1。采用逐孔稀释滴度测定法测定病毒滴度。空载病毒NSE-LV作为对照。 2重组慢病毒转染MSCs及稳定株筛选 NSE-FTH1转染MSCs，48h后显微镜下观察细胞荧光表达情况，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株作为实验组，NSE-LV转染MSCs作为对照组。 3 MSCs体外成神经诱导分化及鉴定 将细胞分别接种于6孔培养板中，1 mmol/L ATRA预诱导24 h，加入MNM神经细胞诱导液诱导24 h，观察所得神经元样细胞形态变化，免疫荧光检测细胞的神经元特异性标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）、巢蛋白（nestin）、微管相关蛋白-2（MAP-2）的表达。 4 MSCs成神经诱导分化前后FTH1表达及聚铁能力检测 Western blot检测MSCs成神经诱导分化前后FTH1基因表达。普鲁士蓝染色及透射电镜观察相应各组细胞内铁颗粒分布。使用 CCK-8试剂盒对各组细胞增殖活性进行检测。HE染色观察各组细胞在表达FTH1及聚铁情况下的细胞形态学变化。 5 MRI观察各组细胞沉淀T2WI信号变化 采用3.0 T MRI行自旋回波（SE）T2WI扫描，观察MSCs成神经诱导分化前后细胞沉淀T2WI信号变化。 结果: 1 NSE-FTH1慢病毒载体的构建与鉴定、病毒包装及滴度测定 成功构建重组慢病毒载体（LV5-NSE-FTH1-GFP-Puro）,包装慢病毒获得病毒滴度约3x108TU/ml，达到实验要求。 2重组慢病毒转染MSCs及稳定株筛选 重组慢病毒成功转染MSCs，获得MSCs-NSE-FTH1，经嘌呤霉素筛选得到稳定株。 3 MSCs体外成神经诱导分化及鉴定 MSCs经过成神经诱导后，细胞形态发生显著改变，呈现神经细胞形态，免疫荧光检测到各组细胞的神经元特异性标志物NSE、巢蛋白、微管相关蛋白-2的呈现强阳性表达。 4MSCs成神经诱导分化前后FTH1表达及聚铁能力检测 Western blot检测MSCs-NSE-FTH1成神经分化后铁蛋白表达量显著增加，其差异有统计学意义(P＜0.01)，CMV启动子组表达量无明显差异(P＞0.05)。普鲁士蓝染色和透射电镜证实Neurons-NSE-FTH1组细胞内较多铁颗粒聚集。CCK-8试剂检测结果显示感染带目的基因的慢病毒或添加FAC培养MSCs后，细胞增殖活性均降低，两种因素共同作用对降低细胞增殖活性更显著。HE染色显示，在表达FTH1及聚铁的情况下，各组细胞形态学未出现异常改变。 5 MSCs-NSE-FTH1成神经诱导分化前后MR成像 MSCs-NSE-FTH1成神经诱导分化后T2WI信号较诱导分化前明显降低，而CMV启动子组诱导分化前后均可见T2WI信号明显降低，说明NSE启动子在MSCs诱导分化为成神经元样细胞后启动了FTH1基因的表达并产生聚铁效应，从而引起MRI信号改变。 结论: NSE启动子在 MSCs成神经分化中能特异性启动报告基因 FTH1表达，并引起MRI信号改变。基于NSE启动子报告基因的MR成像可于MSCs成神经分化事件的监测，这为体内移植MSCs成神经分化的MRI活体示踪奠定了基础。