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[NiFe]氢化酶是一种广泛存在的金属酶，通过催化氢气与氢离子之间可逆的氧化还原反应，实现生物体内的电子转移和能量存储。在E. coli中，[NiFe]氢化酶活性金属中心的形成是一个非常复杂的过程，需要多个辅助蛋白质参与。其中氢化酶大亚基前体的C末端酶切是成熟过程中非常重要的一步，参与这个酶切过程的是一种专一性识别底物的内肽酶，称为氢化酶成熟内肽酶。目前，E. coli中参与氢化酶3成熟的内肽酶HycI和参与氢化酶2成熟的内肽酶HybD是这类内肽酶中研究最深入的，已经解析了与Cd2+结合的HybD的晶体结构，并结合HycI的生化实验结果推测了这类内肽酶家族的可能的活性位点。但是，由于这类内肽酶不含有经典蛋白酶的特征模体，且缺少有效的抑制剂，与底物的复合物的结构也尚未得到解析，因此对它们催化底物水解的分子机制还缺乏了解。为了从分子层面研究氢化酶成熟内肽酶催化氢化酶大亚基前体C末端水解的机理，更好地了解[NiFe]氢化酶活性金属中心的形成过程，我们研究了HycI与底物的相互作用，自由态HycI和HybD的溶液结构和主链动力学性质，并通过比较分析了氢化酶成熟内肽酶对底物特异性识别的影响因素。
主要结果如下：
一、鉴定了HycI与Ni2+结合的位点。Ni2+是体内大亚基C末端酶切反应发生的必要条件，HycI与Ni2+结合的位点位于推测的三个活性残基周围，进一步确定了氢化酶成熟内肽酶活性中心的位置。
二、通过HycI与底物多肽在体外的C末端酶切反应，鉴定了氢化酶成熟内肽酶中起催化作用的残基。我们首次使用模拟大亚基前体的41肽实现了HycI与底物在体外的C末端酶切反应，并且利用这个反应体系和HycI的单点突变体鉴定了保守残基Asp16和Asp62是在酶切反应中起催化作用的残基。
三、应用核磁共振技术解析了自由态HycI与HybD的溶液结构，推测了表面凹槽是底物的结合位点。HycI与HybD整体的折叠相似，都是单结构域的α/β/α型三明治结构，并在分子表面有一个凹槽。活性残基Asp16(Glu16)、Asp62和His90(His93)，保守残基以及与Ni2+结合的残基都位于凹槽的周围，说明了表面凹槽很可能是与底物结合和酶切反应发生的位点。
四、应用核磁共振技术分析了HycI和HybD主链15N的动力学性质。HycI与HybD整体都是比较刚性的蛋白，部分具有显著运动特性的残基主要分布在表面凹槽附近。HycI中有两个同时具有皮秒至纳秒时间尺度内部运动和微秒至毫秒时间尺度构象交换的区域Gly40-Asn45和Asp79-Thr88，HybD中也有一个区域Ile64-Thr70具有相似的动力学性质，它们分布在表面凹槽不同的侧壁，为底物的结合提供了结构的柔性。
五、通过比较HycI和HybD的结构和动力学性质，对氢化酶成熟内肽酶催化底物水解的分子机制及底物识别的特异性提出一些推论。我们推测HycI中有一个优先识别底物的区域，酶切反应可能遵循酸碱催化的机制，并讨论了电荷因素和动力学因素在底物识别特异性中的作用。