论文部分内容阅读
玉米赤霉烯酮(ZEA)是由多种镰刀菌等产生的一种非甾体结构类雌激素样霉菌的毒素,其可被微生物、植物、动物和人类代谢为多种衍生物。研究表明,ZEA可以引起生殖细胞数量的下降、睾丸形态和功能的异常,导致雄性生殖能力下降;还可引起雌性个体受精、胚胎发育和胚胎植入障碍等早期妊娠事件;ZEA及其衍生物能抑制细胞活率,导致细胞凋亡、坏死等变化。睾丸支持细胞(sertoli cells)被认为是保护精子形成过程免受有害影响的屏障细胞,其主要作用之一是构成血睾屏障(BTB),为生殖细胞的发育提供一个独特而稳定的环境。因此,任何能够破坏支持细胞稳定性或功能的药物或毒物都可能对机体内精子形成过程产生影响。目前虽然有大量的研究在探讨ZEA的细胞毒性机制,但其分子毒理机制还未完全阐明。因此,本试验以TM4细胞系(小鼠睾丸支持细胞)为材料,在建立体外ZEA中毒模型的基础上,研究了 ZEA致睾丸支持细胞凋亡和细胞骨架损伤的分子机制,为ZEA中毒病的防控提供科学的理论依据。1.ZEA对TM4细胞增殖和细胞周期分布和相关蛋白表达的影响为了研究不同浓度ZEA对TM4细胞增殖的影响,本试验采用xCELLigence系统实时分析ZEA对TM4细胞增殖的影响;同时用CCK-8试剂检测试剂盒分析ZEA对TM4细胞活率的影响;通过流式细胞仪分析ZEA对TM4细胞周期分布的变化;利用Western Blot分析细胞周期相关调控蛋白CyclinBl、CyclinD1、CDK2和CDK4在蛋白水平上表达的变化。结果显示,经不同浓度的ZEA处理TM4细胞24h后,与空白对照组相比,随着染毒浓度的升高,细胞活率逐渐下降(PP<0.05或P<0.01)并具有现剂量-效应效应;在G0/GI细胞周期中的细胞数量依次下降(P<0.05),而在G2/M期的细胞数量依次增加(PP<0.05或P<0.01)且存在剂量依赖性;同时CyclinB1、CyclinD1、CDK2和CDK4蛋白表达量呈剂量依赖性显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01)。表明,ZEA可以抑制TM4细胞的活率,干扰细胞周期的分布,影响细胞周期相关调控蛋白的表达。2.氧化应激在ZEA干扰TM4细胞周期分布和诱导细胞凋亡的作用为了研究氧化应激在ZEA干扰TM4细胞周期的分布和诱导细胞凋亡的作用,采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定ZEA对TM4细胞乳酸脱氢酶释放的影响,通过流式细胞术、Western Blot和透射电镜(TEM)分析ZEA对TM4细胞凋亡相关指标的影响。结果显示,不同浓度的ZEA处理TM4细胞24h后,随着染毒浓度的升高细胞LDH释放率逐渐上升,细胞凋亡率逐渐升高(P<0.05或P<0.01),Caspase-3活化率呈上升趋势(P<0.05或P<0.01);Bax/Bcl-2蛋白表达的比值,Cleaved-caspase-3和Cleaved-caspase-9蛋白的表达量均呈显著上升或极显著上升(P<0.05或P<0.01);同时氧化应激指标SOD、MDA和ROS等水平逐渐升高(P<0.05或P<0.01),且呈剂量依赖性;ZEA与抗氧化剂NAC共处理,可以缓解ZEA诱导的TM4细胞阻滞和细胞凋亡。结果表明,ZEA可以诱导TM4细胞凋亡和氧化应激水平的升高,并且ZEA可以通过诱导氧化应激水平的升高而引起TM4细胞周期阻滞和细胞凋亡的发生。3.ROS通过内质网应激和ATP/AMPK通路参与ZEA诱导TM4细胞周期阻滞和细胞凋亡为了探讨ROS调控ZEA诱导TM4细胞周期阻滞和细胞凋亡发生的分子机制。本试验通过流式细胞仪分析ZEA对细胞内Ca2+水平,细胞周期分布和细胞凋亡率的变化,采用Western Blot检测内质网应激和AMPK信号通路相关蛋白标的变化,利用试剂盒检测细胞内ATP含量的变化。结果显示,经不同浓度ZEA处理TM4细胞24 h,与对照组相比,随着染毒浓度的增加,细胞内Ca2+水平逐渐升高(P<0.05),内质网应激相关蛋白Bip、PERK、ATF6和CHOP在蛋白水平表达呈显著或极显著升高(P<0.05或PP<0.01),p-AMPKα/AMPKα的比值呈显著升高或极显著升高(P<0.05或P<0.01),细胞内ATP的水平逐渐下降(P<0.05或P<0.01)且具有浓度依懒性。抗氧化剂NAC与ZEA共处理后,可以缓解ZEA引起的TM4细胞内质网应激。内质网应激抑制剂4-PBA与ZEA共处理后,可以缓解ZEA诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡水平。同时4-PBA可以抑制ZEA对ATP/AMPK信号通路的激活。AMPK抑制剂dorsomorphin与ZEA共处理后,缓解了 ZEA诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡水平。表明,ZEA可以引起内质网应激水平的升高以及激活ATP/AMPK信号通路,ZEA可以通过ROS调控细胞内质网应激的发生,同时内质网应激途径可以通过ATP/AMPK信号通路参与调控ZEA诱导TM4细胞周期阻滞和凋亡过程。4.细胞自噬和氧化应激反应在ZEA损伤TM4细胞骨架中的作用为了探讨ZEA对细胞骨架的影响以及细胞自噬和氧化应激在ZEA损伤TM4细胞骨架中的作用。本试验观察了 ZEA对细胞骨架结构和细胞自噬的变化。结果显示,ZEA可以破坏TM4细胞骨架蛋白F-actin和α-tubulin的结构;随着ZEA染毒浓度的增加,Vimentin和N-cadherin表达逐渐下降(P<0.05或P<0.01),TM4细胞内自噬溶酶体和自噬体的数量逐渐增加,自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达逐渐升高(P<0.05或P<0.01),且具有浓度依懒性。促进自噬水平的升高可以加剧ZEA对细胞骨架的影响,而抑制自噬水平可以缓解ZEA对细胞骨架损伤的作用。抗氧化剂NAC与ZEA共处理组,细胞骨架的损伤有所缓和,Vimentin和N-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。表明ZEA可以损伤TM4细胞的骨架结构和诱导TM4细胞自噬水平的升高且氧化应激与细胞自噬都参与了 ZEA对细胞骨架损伤的作用。5.PI3K-AKT-mTOR和MAPK信号通路以及内质网应激反应在ZEA诱导TM4细胞自噬中的作用为了检测PI3K-AKT-mTOR和MAPK信号通路在ZEA诱导TM4细胞自噬中的作用。本试验通过Western Blot分析了 PI3K-AKT-mTOR,MAPK家族蛋白以及自噬相关蛋白的表达的变化,通过激光共聚焦显微镜观察LC3聚点和自噬流的变化。结果显示,随着染毒浓度的升高,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和P-mTOR/mTOR的比例均呈下降趋势(P<0.05或P<0.01),同时MAPK家族蛋白p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK1/2/JNK1/2和p-p38/p38的比值也呈逐渐下降趋势(P<0.05或P<0.01);PI3K抑制剂LY294002和ZEA联合处理,LC3II和Beclin-1蛋白的表达明显升高(PP<0.05或P<0.01),P62蛋白的表达明显下降(P<0.05)。ERK磷酸化抑制剂U0126或ERK2 siRNA抑制ERK信号通路后可以促进ZEA诱导TM4细胞的自噬水平升高,抑制ERK磷酸化或表达后可导致ZEA下调mTOR的作用加剧(P<0.05或PP<0.01)。内质网应激缓解剂4-PBA与ZEA共处理后,可以缓解ZEA对ERK的下调作用(P<0.05)。表明,ZEA可以干扰PI3K-AKT-mTOR和MAPK信号通路蛋白的表达,且PI3K-AKT-mTOR和MAPK信号通路参与了 ZEA诱导的TM4细胞自噬的过程。内质网应激能通过下调ERK信号途径降低mTOR的磷酸化诱导自噬的发生。结论:ROS可以通过内质网应激和ATP/AMPK信号通路参与调控ZEA诱导的TM4细胞周期阻滞和细胞凋亡过程。内质网应激-自噬-氧化应激通路参与ZEA对TM4细胞骨架损伤的过程。