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动脉粥样硬化(AS)是由于内皮损伤和内皮下脂蛋白滞留引发的动脉壁慢性炎症性疾病，尤其是在血流紊乱部位动脉损伤最为严重，是导致心肌梗塞、脑卒中、外周动脉疾病发生的主要病因，具有较高的发病率、致残率、死亡率。作为一种全身性疾病，AS的发生是一个复杂的过程，其中年龄增长，高血压、高血糖、高血脂等疾病，吸烟、嗜酒等不良生活习惯均可导致AS的发生，除此之外，机体代谢障碍、胰岛素抵抗、高尿酸血症等也被认为是导致AS发生的主要原因。AS的发病机制是一个多阶段过程，其中炎症介质在AS发生中扮演重要角色，随着脂质的沉积和炎症因子的不断刺激，动脉管壁形成脂纹并进一步发展成斑块，最终导致动脉管腔完全或不完全闭塞。
microRNA(miRNA)是一种进化上相对保守的内生性单链非编码小RNA，长度约为20-24个核苷酸。miRNA通过与靶mRNA3-端非翻译区(3-UTR)发生互补配对使mRNA转录或翻译过程受到抑制。到目前为止，miRNAs已被证实可作为AS发展中重要的调节因子和涉及AS的病理生理细胞效应和分子信号传导途径的调节剂，通过调控关键的信号通路或脂质代谢通路影响AS斑块形成。miR-590是位于人基因组7号染色体上的功能性miRNA，可通过调控下游信号转导途径调控包括AS在内的多种心血管疾病的发生。
TLR4是参与机体炎症反应的重要蛋白，主要通过髓样分化因子88(MyD88)依赖途径或非依赖途径调控NF-κB活性，影响包括炎性因子、粘附因子和趋化因子在内的多种蛋白表达，最终影响AS的炎症发生。尽管TLR4/NF-κB通路在AS发生中的作用已被验证，但目前缺乏有力证据证明miR-590能否通过调控TLR4/NF-κB信号通路影响AS进程。
本研究通过构建AS小鼠模型和ox-LDL血管内皮损伤细胞模型，研究miR-590在小鼠动脉组织和细胞中的表达及miR-590过表达对AS发生发展的调控，并对miR-590的靶基因进行预测及验证，以进一步探究miR-590调控AS进程的分子机制，为AS临床诊断以及靶向治疗提供可靠依据。
第一部分miR-590在AS体内外的表达及对动脉粥样硬化病变的影响
研究方法
1.体内动物实验
1.1.利用高脂饮食饲喂ApoE-/-小鼠，构建AS小鼠模型。采用qRT-PCR分析野生型C57BL/6J小鼠和AS小鼠动脉组织中miR-590的表达差异。
1.2.通过体内注射miR-590agomir构建miR-590过表达AS小鼠模型。
1.3.伊文思蓝和HE染色法分析miR-590过表达对AS小鼠斑块形成和主动脉窦动脉硬化病变的影响。
1.4.利用全自动生化分析仪测定miR-590过表达组和正常对照组AS小鼠血清中脂蛋白HDL-C、TC、LDLC、TG水平的差异。
2.细胞实验
2.1.ox-LDL诱导人主动脉内皮细胞(HAECs)损伤。采用qRT-PCR分析ox-LDL诱导的HAECs和正常HAECs中miR-590的表达差异。
2.2.采用脂质体转染法将miR-590agomir、miR-590inhibitor及相应的对照miRNAs转染到ox-LDL诱导的HAECs，采用qRT-PCR分析各组细胞中miR-590的表达水平，分析各组细胞转染效率。
2.3.MTT、流式细胞术、westernblot方法分析miR-590过表达或抑制对ox-LDL损伤的HAECs增殖、凋亡和细胞中凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达的影响。
结果
1.体内动物实验
1.1.成功构建ApoE-/-小鼠AS模型，qRT-PCR结果显示，与野生型C57BL/6J小鼠相比，高脂饲喂的ApoE-/-小鼠主动脉组织中miR-590的表达水平显著降低(P＜0.05)。
1.2.通过注射miR-590agomir成功构建miR-590过表达AS小鼠模型。
1.3.伊文思蓝和HE染色结果显示，与对照组相比，miR-590过表达明显抑制AS小鼠斑块形成并减少主动脉窦动脉硬化病灶面积(P＜0.05)。
1.4.血脂水平分析结果显示，与对照组相比，miR-590过表达明显降低AS小鼠血清中脂蛋白HDL-C、TC、LDLC、TG的水平(P＜0.05)。
2.细胞实验
2.1.qRT-PCR结果显示，与正常HAECs相比，ox-LDL诱导的HAECs中miR-590的表达水平显著降低(P＜0.05)。
2.2.成功构建miR-590过表达或抑制细胞模型。
2.3.MTT、流式细胞术、westernblot分析结果显示，与对照组相比，miR-590过表达促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，并降低凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达(P＜0.05)；相反的，miR-590敲低抑制细胞增殖，促进细胞凋亡并增加PARP、caspase-3表达(P＜0.05)。
结论
1.成功构建ApoE-/-小鼠AS模型和ox-LDL损伤的HAECs模型。
2.miR-590通过缓解AS小鼠主动脉病变，并促进ox-LDL损伤HAECs生长缓解AS病变。
第二部分miR-590通过调节TLR4基因影响血管内皮细胞功能的可能性研究
研究方法
1.miRcode生物学软件预测miR-590的靶基因。
2.双荧光素酶报告分析miR-590过表达或抑制对TLR4-WT或TLR4-MUT重组质粒荧光素酶活性的影响。
3.采用westernblot方法分析TLR4在AS小鼠动脉组织和ox-LDL诱导的HAECs中的表达，以及miR-590过表达或抑制对TLR4蛋白表达的影响。
4.采用MTT、流式细胞术和westernblot方法分析单独敲低TLR4或敲低TLR4和miR-590对ox-LDL损伤的HAECs增殖、凋亡和细胞中凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达的影响。
结果
1.miRcode分析结果显示，TLR4是miR-590的一个潜在靶基因。
2.双荧光素酶报告分析结果显示，与对照组相比，miR-590过表达降低野生型TLR4报告质粒活性(P＜0.05)，miR-590敲低增强野生型TLR4报告质粒活性(P＜0.05)，但miR-590过表达或敲低对突变型TLR4报告质粒活性无影响。
3.Westernblot结果显示，与野生型C57BL/6J小鼠和正常HAECs相比，高脂饲喂的ApoE-/-小鼠主动脉组织和ox-LDL诱导的HAECs中TLR4的表达水平显著升高(P＜0.05)；上调miR-590抑制TLR4蛋白表达(P＜0.05)，而下调miR-590促进TLR4蛋白表达(P＜0.05)。
4.MTT、流式细胞术、westernblot结果显示，miR-590敲低逆转TLR4敲低对细胞增殖的抑制，对凋亡的促进，以及对凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达的促进作用。
结论
1.证实TLR4是miR-590的一个靶基因。
2.miR-590通过靶向抑制TLR4促进ox-LDL诱导的HAECs生长，最终参与AS发生发展的调控。
第三部分miR-590通过调控TLR4/NF-κB信号通路影响动脉粥样硬化的机制研究
研究方法
1.采用westernblot方法测定miR-590agomir单独转染或miR-590agomir和pcDNA-TLR4共转染细胞后NF-κB信号通路相关蛋白表达。
2.在ox-LDL处理的HAECs中加入NF-κB信号通路抑制剂，构建NF-κB通路抑制细胞模型。
3.采用MTT、流式细胞术、westernblot方法分析NF-κB信号通路抑制对ox-LDL处理的HAECs增殖、凋亡和细胞中凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达的影响。
结果
1.Westernblot结果显示，TLR4转染逆转miR-590对NF-κB信号通路相关蛋白p-p65、p-IκBα表达的抑制作用。
2.成功构建NF-κB通路抑制的血管内皮细胞模型。
3.MTT、流式细胞术、westernblot分析结果显示，抑制NF-κB信号通路能够促进血管内皮细胞增殖活性，抑制细胞凋亡和凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达。
结论
1.miR-590通过靶向TLR4抑制NF-κB信号通路活性。
2.NF-κB信号通路活性抑制可促进ox-LDL诱导的HAECs生长，预防AS发生发展。
microRNA(miRNA)是一种进化上相对保守的内生性单链非编码小RNA，长度约为20-24个核苷酸。miRNA通过与靶mRNA3-端非翻译区(3-UTR)发生互补配对使mRNA转录或翻译过程受到抑制。到目前为止，miRNAs已被证实可作为AS发展中重要的调节因子和涉及AS的病理生理细胞效应和分子信号传导途径的调节剂，通过调控关键的信号通路或脂质代谢通路影响AS斑块形成。miR-590是位于人基因组7号染色体上的功能性miRNA，可通过调控下游信号转导途径调控包括AS在内的多种心血管疾病的发生。
TLR4是参与机体炎症反应的重要蛋白，主要通过髓样分化因子88(MyD88)依赖途径或非依赖途径调控NF-κB活性，影响包括炎性因子、粘附因子和趋化因子在内的多种蛋白表达，最终影响AS的炎症发生。尽管TLR4/NF-κB通路在AS发生中的作用已被验证，但目前缺乏有力证据证明miR-590能否通过调控TLR4/NF-κB信号通路影响AS进程。
本研究通过构建AS小鼠模型和ox-LDL血管内皮损伤细胞模型，研究miR-590在小鼠动脉组织和细胞中的表达及miR-590过表达对AS发生发展的调控，并对miR-590的靶基因进行预测及验证，以进一步探究miR-590调控AS进程的分子机制，为AS临床诊断以及靶向治疗提供可靠依据。
第一部分miR-590在AS体内外的表达及对动脉粥样硬化病变的影响
研究方法
1.体内动物实验
1.1.利用高脂饮食饲喂ApoE-/-小鼠，构建AS小鼠模型。采用qRT-PCR分析野生型C57BL/6J小鼠和AS小鼠动脉组织中miR-590的表达差异。
1.2.通过体内注射miR-590agomir构建miR-590过表达AS小鼠模型。
1.3.伊文思蓝和HE染色法分析miR-590过表达对AS小鼠斑块形成和主动脉窦动脉硬化病变的影响。
1.4.利用全自动生化分析仪测定miR-590过表达组和正常对照组AS小鼠血清中脂蛋白HDL-C、TC、LDLC、TG水平的差异。
2.细胞实验
2.1.ox-LDL诱导人主动脉内皮细胞(HAECs)损伤。采用qRT-PCR分析ox-LDL诱导的HAECs和正常HAECs中miR-590的表达差异。
2.2.采用脂质体转染法将miR-590agomir、miR-590inhibitor及相应的对照miRNAs转染到ox-LDL诱导的HAECs，采用qRT-PCR分析各组细胞中miR-590的表达水平，分析各组细胞转染效率。
2.3.MTT、流式细胞术、westernblot方法分析miR-590过表达或抑制对ox-LDL损伤的HAECs增殖、凋亡和细胞中凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达的影响。
结果
1.体内动物实验
1.1.成功构建ApoE-/-小鼠AS模型，qRT-PCR结果显示，与野生型C57BL/6J小鼠相比，高脂饲喂的ApoE-/-小鼠主动脉组织中miR-590的表达水平显著降低(P＜0.05)。
1.2.通过注射miR-590agomir成功构建miR-590过表达AS小鼠模型。
1.3.伊文思蓝和HE染色结果显示，与对照组相比，miR-590过表达明显抑制AS小鼠斑块形成并减少主动脉窦动脉硬化病灶面积(P＜0.05)。
1.4.血脂水平分析结果显示，与对照组相比，miR-590过表达明显降低AS小鼠血清中脂蛋白HDL-C、TC、LDLC、TG的水平(P＜0.05)。
2.细胞实验
2.1.qRT-PCR结果显示，与正常HAECs相比，ox-LDL诱导的HAECs中miR-590的表达水平显著降低(P＜0.05)。
2.2.成功构建miR-590过表达或抑制细胞模型。
2.3.MTT、流式细胞术、westernblot分析结果显示，与对照组相比，miR-590过表达促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，并降低凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达(P＜0.05)；相反的，miR-590敲低抑制细胞增殖，促进细胞凋亡并增加PARP、caspase-3表达(P＜0.05)。
结论
1.成功构建ApoE-/-小鼠AS模型和ox-LDL损伤的HAECs模型。
2.miR-590通过缓解AS小鼠主动脉病变，并促进ox-LDL损伤HAECs生长缓解AS病变。
第二部分miR-590通过调节TLR4基因影响血管内皮细胞功能的可能性研究
研究方法
1.miRcode生物学软件预测miR-590的靶基因。
2.双荧光素酶报告分析miR-590过表达或抑制对TLR4-WT或TLR4-MUT重组质粒荧光素酶活性的影响。
3.采用westernblot方法分析TLR4在AS小鼠动脉组织和ox-LDL诱导的HAECs中的表达，以及miR-590过表达或抑制对TLR4蛋白表达的影响。
4.采用MTT、流式细胞术和westernblot方法分析单独敲低TLR4或敲低TLR4和miR-590对ox-LDL损伤的HAECs增殖、凋亡和细胞中凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达的影响。
结果
1.miRcode分析结果显示，TLR4是miR-590的一个潜在靶基因。
2.双荧光素酶报告分析结果显示，与对照组相比，miR-590过表达降低野生型TLR4报告质粒活性(P＜0.05)，miR-590敲低增强野生型TLR4报告质粒活性(P＜0.05)，但miR-590过表达或敲低对突变型TLR4报告质粒活性无影响。
3.Westernblot结果显示，与野生型C57BL/6J小鼠和正常HAECs相比，高脂饲喂的ApoE-/-小鼠主动脉组织和ox-LDL诱导的HAECs中TLR4的表达水平显著升高(P＜0.05)；上调miR-590抑制TLR4蛋白表达(P＜0.05)，而下调miR-590促进TLR4蛋白表达(P＜0.05)。
4.MTT、流式细胞术、westernblot结果显示，miR-590敲低逆转TLR4敲低对细胞增殖的抑制，对凋亡的促进，以及对凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达的促进作用。
结论
1.证实TLR4是miR-590的一个靶基因。
2.miR-590通过靶向抑制TLR4促进ox-LDL诱导的HAECs生长，最终参与AS发生发展的调控。
第三部分miR-590通过调控TLR4/NF-κB信号通路影响动脉粥样硬化的机制研究
研究方法
1.采用westernblot方法测定miR-590agomir单独转染或miR-590agomir和pcDNA-TLR4共转染细胞后NF-κB信号通路相关蛋白表达。
2.在ox-LDL处理的HAECs中加入NF-κB信号通路抑制剂，构建NF-κB通路抑制细胞模型。
3.采用MTT、流式细胞术、westernblot方法分析NF-κB信号通路抑制对ox-LDL处理的HAECs增殖、凋亡和细胞中凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达的影响。
结果
1.Westernblot结果显示，TLR4转染逆转miR-590对NF-κB信号通路相关蛋白p-p65、p-IκBα表达的抑制作用。
2.成功构建NF-κB通路抑制的血管内皮细胞模型。
3.MTT、流式细胞术、westernblot分析结果显示，抑制NF-κB信号通路能够促进血管内皮细胞增殖活性，抑制细胞凋亡和凋亡相关蛋白PARP、caspase-3表达。
结论
1.miR-590通过靶向TLR4抑制NF-κB信号通路活性。
2.NF-κB信号通路活性抑制可促进ox-LDL诱导的HAECs生长，预防AS发生发展。