【摘 要】
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细菌光敏色素(BphP)是一类在各种细菌中广泛存在的光受体蛋白,结合了胆绿素分子(BV)后能够对红光或者远红光具有响应。它通常具有两种较稳定的光存在形式,分别是吸收红外的Pr
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细菌光敏色素(BphP)是一类在各种细菌中广泛存在的光受体蛋白,结合了胆绿素分子(BV)后能够对红光或者远红光具有响应。它通常具有两种较稳定的光存在形式,分别是吸收红外的Pr态和吸收远红光的Pfr态。当使用红外或远红外照射的情况下这两种状态可以相互转换。近年来在这类蛋白的基础上,通过蛋白质工程手段改造后,可以获得近红外荧光蛋白,这类蛋白在近红外荧光成像、近红外光声成像等领域已经成功运用。PAiRFP1是在根癌农杆菌细菌光敏色素Agp2的基础上,通过定向进化的手段筛选得到的近红外荧光蛋白,它已成功应用到了肿瘤的活体成像研究,但关于PAiRFP1是否具有其它运用尚未研究。在本文中,我们首先在成功诱导表达、纯化该蛋白的基础上,脱辅基蛋白与BV进行了体外组装,然后研究了该蛋白作为近红外生物传感器检测Hg2+的可能性。我们发现伴随着Hg2+浓度增加,BV的近红外荧光逐渐被猝灭。类似荧光猝灭现象在氧化型离子(包括Fe3+,Cu2+,Ag+)存在情况下也能观察到。不同于上述现象,当体系中加入K+,Mg2+,NH4+,Mn2+等离子时近红外荧光轻微增加,这是由于光激活所致。上述结果初步表明PAiRFP1作为Hg2+生物传感器时特异性不高。其次,我们针对BV结合口袋附近的三个氨基酸残基,包括V276,C277,C280,开展了定点突变。光谱学研究显示:V276的氨基酸残基对于近红外最大吸收峰位置(λmax)、近红外最大荧光发射峰位置(Fmax)、荧光量子产率影响较大;当Val突变成Gly后,λmax和Fmax分别红移了15 nm和11 nm左右;同时相对荧光量子产率降低至~64.1%。我们随后针对V276开展了饱和突变,获得了一些初步的光谱学结果。上述这些工作为后续开展近红外光声成像奠定了基础。
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