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ε-聚赖氨酸(ε-Polylysine,ε-PL)是L-赖氨酸的多聚物,通常聚合度为25-30左右,是链霉菌、北里孢菌等微生物的天然代谢产物。它是一种新型的天然食品防腐剂,不但对人体健康无害,而且分解代谢后还具有一定的营养价值,能够抑制大部分的革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌、真菌和一些耐热性芽孢杆菌等,具有广谱抗菌性。此外,e-PL具有安全性高,水溶性强,热稳定性好等特点,在食品防腐、医疗制药、生物科学和环境科学等领域具有广阔的应用前景。
本研究对ε-PL产生菌进行了筛选、鉴定、诱变育种和发酵条件优化等研究,主要研究结果如下:
1.采集广东等地30种不同的土壤,经在不含指示剂的SG平板上进行透明圈初筛,获得40株产透明圈菌株。通过建立一种快速简便的筛选ε-PL产生菌的新方法,即用Dragendorff试剂与产透明圈菌株周围产生砖红色聚集圈的方法进行复筛,进一步获得了24株疑似菌株。将这些疑似菌株的发酵产物进行抑菌实验、离子交换层析、薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析,确定22株菌株的发酵产物为聚赖氨酸。对其中一株聚赖氨酸产量最高的菌株YB12的产物进行傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和氢谱核磁共振(1H NMR)分析,同时结合Chemdraw软件模拟分析法共同确定了其单体连接方式为ε型,即菌株YB12为ε-PL产生菌。Tricine-SDS-PAGE鉴定其产物ε-PL分子量为4.85 Kda,聚合度约为33。
2.对YB12菌株进行了形态特征、培养特征和生理生化特征鉴定,同时结合16S rDNA分子鉴定,结果表明,ε-聚赖氨酸产生菌YB12为白色链霉菌(Streptomyces albus)。
3.采用硫酸二乙酯(DES)化学诱变法对YB12进行了诱变,结合在不同时间内诱变的致死率,确定了DES最佳诱变时间为30min。经DES诱变,通过建立一种新的诱变筛选方法,即在含有7 mg/mL S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)和0.002％亚甲基蓝的平板上进行突变株筛选,再通过发酵复筛及遗传稳定性实验,获得了2株稳定的ε-聚赖氨酸高产突变株YB13-2和YB47-3,其ε-PL产量相对野生菌株YB12分别提高了13.03%和10.90%。选取ε-PL产量最高的突变株YB13-2进行发酵条件优化。
4.在基础发酵培养基的基础上,利用单因素实验对不同碳源和不同氮源进行了考察,借助Design Expert7.1.3统计学软件,采用Plackett-Burman实验与响应面分析(RSM)相结合的实验统计方法进行产ε-PL培养基的优化和数据分析,从而有效地筛选出主效应因素并实现了培养基组分的优化,得到最佳响应值,进而确定了YB13-2产ε-PL的最优体系为:甘油42.29 g,酵母膏8.16 g,NH4/NO310.75 g,Na2HPO40.8 g,KH2PO41 g,MgSO4·7H2O0.25 g,ZnSO4.7H2O0.05 g,FeSO4.7H2O0.01 g。
5.采用不同的温度、转速、装液量、初始pH和接种量等单因素实验对YB13-2发酵产ε-PL的培养条件进行了优化,结果表明培养温度30℃、转速220 rpm、装液量100 mL、初始pH值7.0和接种量8%为其最佳培养条件。通过以上发酵条件优化,YB13-2的ε-聚赖氨酸产量可达168.91 mg/L,相对未优化之前提高了27.28%。