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目前,对家蚕(Bombyx mori)等鳞翅目昆虫在蜕皮和变态发育过程中幼虫组织的细胞自噬研究已取得一些进展,但还有许多关键问题没有解决。例如至今没有获得可以确证细胞发生自噬的关键自噬蛋白LC3(Atg8)表达的证据,通过普通电镜难以观察到自噬体的双层膜,对大量出现的单层膜小泡-“spherite”或称“granules”和其互相融合的空泡无法确证就是自噬小泡。
自噬蛋白Atg8在自噬泡(包括自噬体和自噬小泡)形成中起重要作用,它是细胞自噬体发生和发展过程中唯一留存的自噬蛋白,是确认细胞自噬的最直接证据。通过Atg8表达的Western blot检测和免疫电镜的亚细胞定位分析是解决上述问题的关键证据。
本文通过透射电镜观察自噬体的形态,制备家蚕自噬蛋白BmAtg8抗体进行Western blot检测和免疫电镜分析,对家蚕4龄眠10h和化蛹48h的中肠细胞和4龄眠10h的微气管丛细胞发生的自噬体和小泡的发展特征进行研究,为解析上述问题和今后深入研究家蚕等鳞翅目昆虫蜕皮和变态发育的细胞自噬机制提供关键证据和关键技术。
本研究主要获得以下结果:
(1)通过pET-28b-BmAtg8/E.coli Rosetta系统表达和纯化BmAtg8蛋白,免疫新西兰大白兔,制作抗血清,获得在一抗1:2000和二抗1:10,000工作条件下可检测15ngBmAtg8蛋白的抗血清效价。
(2)通过Western blot检测,获得BmAtg8(-PE)蛋白在5龄5天(5L5D)-化蛹4天(PD4)的中肠组织和5L5D-P12h的丝腺组织中表达的关键证据,其表达特征与已知该时期BmAtg8的基因表达活性相吻合,这也是家蚕自噬研究中首次成功地应用Western blot检测自噬蛋白Atg8的表达。
(3)通过透射电子显微镜检测,成功地在化蛹48h中肠细胞中观察到大量具双层膜结构的非选择性吞噬“结构性内含物”和/或“小泡”的自噬体、吞噬线粒体的自噬体(线粒体自噬),同时也观察到无膜结构的致密小体。推测吞噬细胞组分的小泡或进入自噬体被降解,或随着自噬的进程相互融合而降解。
(4)首次初步建立了家蚕自噬蛋白BmAtg8的免疫电镜技术,通过其抗体胶体金标记的定位分析,为确证在家蚕眠期、化蛹期的中肠和微气管的细胞自噬进程中发生的自噬体、线粒体自噬、自噬小泡及其融合降解特征提供了直接证据。
(5)由BmAtg8免疫电镜定位分析结果,提示在家蚕的蜕皮发育时期,附着于中肠的微气管组织和其内、外膜区域也是通过自噬降解实现更新和替代的。