论文部分内容阅读
萝芙木属植物是一类重要的药用植物，在其中已发现多达200种吲哚生物碱，吲哚生物碱被用来治疗多种疾病。吲哚生物碱阿吗灵就是其中最复杂的一个药用生物碱，它包含了一个含有九个手性碳原子的高度复杂的六元环，阿吗灵代谢包含超过10个不同的步骤，而polyneuridinealdehydeesterase(PNAE)酶就恰恰处在该酶系系列的中间部分，催化polyneuridinealdehyde(PNA)转化为epi-vellosimine的关键步骤，PNAE酶的反应速率对阿吗灵合成代谢中起到了一个关键的调控作用。目前，在云南萝芙木中未见有关于PNAE酶基因克隆的报道，因此，对云南萝芙木中PNAE酶基因的克隆对提高阿吗灵的产量具有深远的指导意义，本论文的主要研究结果如下:
1)在NCIB生物信息学网站上搜索PNAE酶的相关蛋白质和mRNA全长序列，利用生物信息学比对软件比对得到的蛋白质和mRNA全长序列，获得PNAE酶cDNA序列可能的大致保守区域，然后根据已知的其他物种PNAE酶cDNA序列来设计PCR引物，采用RT-PCR技术从本实验室温室中栽种的云南萝芙木上取新鲜的叶片，提取高质量的总RNA，然后进行反转后PCR扩增获得pnae基因部分cDNA序列即PNAE酶基因中间保守大片段，最后利用RACE技术来进行5’和3RACE实验以获取PNAE酶基因中间保守大片段两端的序列。通过拼接获得的三段序列我们得到了完整的1004bp的PNAE酶基因cDNA全长序列。
2)根据获得的pnae基因cDNA全长序列，分析得到795bp的开放阅读框，编码264个氨基酸。进一步的序列比对分析发现，云南萝芙木中PNAE酶氨基酸序列与蛇根木中的该酶氨基酸序列同源性高达90％，但和其他植物物种中的PNAE酶氨基酸序列，以及其他物种间的PNAE酶氨基酸序列同源性都不高在40％-60％之间，表明不同物种中PNAE酶氨基酸序列不具有全序列的高度同源性。
3)再进一步序列分析表明，在各植物的PNAE酶氨基酸序列中都存在两个高度保守的氨基酸区域，表明不同物种中PNAE酶存在共同的高度保守区段，其中一个保守区域相似水解酶一般存在的四疏水氨基酸保守区，即一个甘氨酸环绕一个组氨酸所组成的严格保守区域，另一个保守区和a/b水解酶超家族的活性中心的保守区段几乎相同，所以PNAE酶为a/b水解酶超家族的新成员.
4)总的来说，将来对PNAE在其它物种中的克隆可以利用到这两个保守区段。