高产几丁质酶菌株的筛选与CK1-3菌株几丁质酶的纯化与鉴定

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几丁质(chitin)又名甲壳素,是地球上蕴藏量最丰富的有机物之一。每年的生物合成量达100亿吨之多,其年产量仅次于纤维素,储量居第二位,是地球上一种取之不尽用之不竭的可再生天然资源。几丁质酶能专一性催化水解N-乙酰-D-葡萄糖胺糖苷键,降解几丁质得到几丁寡糖、水溶性几丁质或N-乙酰氨基葡萄糖。从微生物中筛选产几丁质酶菌株,并进行酶的研究,不仅具有一定的学术价值,而且对几丁质天然资源的清洁生产与广泛利用,如生物防治、环境保护、医药食品等领域的应用都具有重要的实际意义。本研究对高产几丁质酶的菌株进行了较广泛的筛选,从江西地区河流、湖泊的泥样与中药材栝蒌中分离、筛选出90株可产几丁质酶的菌株,作为高产几丁质酶的候选菌株。对其中一株具有明显产几丁质酶能力的CK1-3,进行了酶的分离纯化与酶学研究。经初步鉴定,CK1-3菌为酵母菌。优化了菌株CK1-3的发酵条件。确定了其产几丁质酶最适培养基组分为:胶体几丁质8.0,蛋白胨5,酵母膏5,K2HPO4 0.7, KH2PO4 0.3, MgSO4﹒7H2O 0.5, FeSO4·7H2O 0.01, ZnSO4 0.01, PH 6.8;最适产酶培养条件为:培养基起始pH值6.8,接种量1.4%(w/v),以250ml三角瓶装瓶量为50ml,培养温度30 oC,180r/min摇瓶培养120h,发酵液酶活力可达2.51U/mL。建立了菌株CK1-3发酵液中几丁质酶的分离纯化条件。发酵液经冷冻离心后,上清液85%冰酒精沉降、离心、溶于少量的蒸馏水中,制得几丁质酶粗提液。粗酶液经Sephadex G-100筛分纯化后,即获得大分子几丁质酶。酶纯化倍数为6.61,收率为37.2%。SDS-PAGE电泳显示为电泳纯,分子量为46000Da。对CK1-3菌株产几丁质酶进行酶学性质的研究,结果表明该几丁质酶的最适反应温度为50 oC,最适反应pH为6.0;酶活力在pH 6.0~7.5之间时相对稳定;Mg2+、Fe2+对酶的活性有较好的促进作用,而Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+等离子对酶活力均有不同程度的抑制。
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