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免疫应答的调控一直是免疫学领域的研究重点，其中负向免疫调控近年来尤其受到重视。调节性T细胞（regulatory T cells）的发现及其功能的阐明大大丰富了人们对免疫应答及免疫耐受的认识，并且已在临床诸多学科产生重要影响。对于B细胞，我们通常认为其通过产生抗体、提供协同刺激信号而发挥正向免疫调节作用，但实际上B细胞也具有重要的负向免疫调节功能。1996年，Janeway等人在B细胞缺陷小鼠（μMT小鼠）诱导EAE，出现更严重的临床症状，并且进行性加重，首次明确了调节性B细胞的存在和功能。1997年Bhan等将μMT小鼠与自发产生结肠炎的TCRα链敲除小鼠（TCRα-/-小鼠）交配，子代小鼠出现肠炎的症状更早且更严重，表明B细胞在T细胞介导的炎症反应中具有重要的抑制作用，据此研究者提出了“调节性B细胞”的概念。之后又在I型糖尿病、胶原诱导的关节炎、系统性红斑狼疮、接触性皮炎等多种自身免疫性疾病和炎症性疾病的小鼠模型中验证了B细胞负向免疫调节功能的存在。此外，在变态反应、肿瘤免疫、抗感染免疫，B细胞也发挥了重要的负向免疫调节作用。 2008年Tedder研究组首次在正常小鼠脾脏中鉴定出了一个调节性B细胞亚群，其表型为CD5+CD1dhighCD19+，由于其负向免疫调节功能依赖于IL-10，为区别于其他可能存在的调节性B细胞亚群，将这一调节性B细胞亚群命名为B10细胞。B10细胞的鉴定是调节性B细胞研究领域的重要进展，为进一步研究其功能和发育特点奠定了一定的基础。 BCR是B细胞发育过程中的核心分子，其特异性和信号强度对B细胞的发育具有关键性的作用。B10细胞作为B细胞的一个亚群，尽管其功能不同于普通的B细胞，但BCR仍然是其发育和发挥功能的关键分子。本研究选择B10细胞的产生机制这一关键问题，从BCR信号强度和特异性的角度进行深入研究。我们前期工作中建立了表面BCR密度不同的2系能够识别自身抗原的BCR转基因小鼠-TgVH3B4，我们利用2系TgVH3B4小鼠分析了BCR识别自身抗原的特异性和信号强度对小鼠B10细胞发育的影响，给予TgVH3B4小鼠和转基因阴性小鼠皮下注射自身抗原Actin和外来抗原OVA，分析识别不同抗原的BCR特异性对B10细胞的诱导作用，并且在不同体外刺激下对小鼠脾细胞进行培养，分析强度不同的BCR刺激和CD40等刺激对B10细胞活化和成熟的作用。 主要实验方法： 1）用anti-CD19磁珠分选WT小鼠脾脏CD19+ B细胞，流式细胞仪进一步分选CD5+CD1dhighCD19+B细胞和CD5-CD19+B细胞，在预包被keratin、actin、myosin、PC、LPC、LPS和OVA等7种抗原的96孔ELISPOT板中进行培养，每孔加入1.5×105个细胞培养48 h，分析CD5+CD1dhighCD19+ B细胞和CD5-CD19+ B细胞中识别自身抗原和外来抗原的细胞数； 2）取WT小鼠、11＃、39# TgVH3B4小鼠脾脏、腹腔细胞，流式细胞仪分析不同小鼠脾脏中CD5+CD1dhighCD19+B细胞比例，不加任何刺激或LPS+PIM刺激5 h的情况下，PE/Cy5-anti-CD19细胞表面染色，固定、破膜，PE-anti-IL-10细胞内染色，流式细胞仪分析脾脏和腹腔CD19+IL-10+B细胞比例； 3）TgVH3B4小鼠脾细胞体外培养5 h，给予LPS+PIM刺激，分别用PE/Cy5-anti-CD19和Biotin-anti-IgMa/Avidin-FITC或PE/Cy5-anti-CD19和FITC-actin细胞表面染色，固定、破膜，PE-anti-IL-10细胞内染色，流式细胞仪分析 IgMa+、Actin+B细胞中IL-10的表达； 4）WT小鼠脾脏细胞体外培养5 h，分别给予PIM、LPS+PIM、soluble anti-IgM mAb、coated anti-IgM mAb等对细胞进行刺激，PE/Cy5-anti-CD19细胞表面染色，固定、破膜，PE-anti-IL-10细胞内染色，流式细胞仪分析CD19+IL-10+B细胞比例，明确B10细胞活化的信号特点； 5）WT小鼠脾脏细胞体外培养48 h，分别给予LPS、soluble anti-IgM mAb、coated anti-IgM mAb、anti-CD40 mAb(IgG)或anti-CD40 mAb(IgM)进行体外刺激，以及采用anti-CD40 mAb(IgG)+soluble anti-IgM mAb、anti-CD40 mAb(IgG)+coated anti-IgM mAb、anti-CD40 mAb(IgM)+soluble anti-IgM mAb、anti-CD40 mAb(IgM)+coated anti-IgM mAb等不同的联合刺激方案对细胞进行体外刺激，最后5 h加入 PIM， PE/Cy5-anti-CD19细胞表面染色，固定、破膜，PE-anti-IL-10细胞内染色，流式细胞仪分析CD19+IL-10+B细胞表达情况； 6）WT小鼠、2系TgVH3B4小鼠皮下注射Actin、OVA，40μg/ml，每周1次，共3次，间隔1周后取小鼠外周血，ELISA分析小鼠外周血抗-Actin和抗-OVA IgG表达水平；同时取小鼠脾细胞， PE/Cy5-anti-CD19、PE-anti-CD5、Biotin-anti-CD1d/Avidin-FITC染色，流式细胞仪分析小鼠脾脏CD5+CD1dhighCD19+B细胞的变化。 主要研究结果和结论： 野生C57BL/6小鼠脾脏CD5+CD1dhighCD19+B细胞亚群中识别自身抗原keratin、myosin、actin、LPC、PC的细胞数明显高于CD5-CD19+B亚群；而识别外来抗原LPS、OVA的细胞数在CD5+CD1dhighCD19+B细胞亚群和CD5-CD19+B细胞亚群中无明显差异。 TgVH3B4小鼠脾脏CD5+CD1dhighCD19+B细胞比例明显升高，在不加任何刺激和LPS+PIM5 h刺激的情况下，其脾脏和腹腔CD19+IL-10+B细胞比例也明显升高，且这种变化趋势在表面BCR密度较高的39系转基因小鼠更加明显。 转基因IgMa+B细胞亚群中IL-10的表达明显高于IgMa-B细胞亚群；能够识别自身抗原Actin的Actin+B细胞亚群中IL-10的表达也明显高于Actin-B细胞亚群；皮下注射Actin可进一步诱导TgVH3B4小鼠脾脏CD5+CD1dhighCD19+B细胞的扩增，而给 TgVH3B4小鼠注射 OVA或给转基因阴性小鼠注射 Actin均不会诱导小鼠脾脏CD5+CD1dhighCD19+B细胞的扩增。 在体外刺激5 h时，能够更有效诱导BCR交联的coated anti-IgM mAb刺激有利于B10细胞的活化并促进B细胞CD5分子的表达；体外刺激48 h时，coated anti-IgM mAb刺激对B细胞表达IL-10具有抑制作用，且对CD40信号诱导B10pro细胞成熟的抑制作用更强。 本研究明确了小鼠B10细胞具有识别自身抗原的特异性，识别自身抗原对B10细胞发育和扩增具有重要作用，同时较强的BCR信号也有利于B10细胞的发育。在体外刺激的情况下，BCR信号对B10细胞成熟、活化的作用依赖于BCR信号强度、作用时间等。本研究结果进一步明确了调节性 B细胞作为独立细胞亚群的存在并阐明BCR信号与其发育、成熟、活化的关系，为下一步有针对性的调控其功能和临床应用奠定了基础。