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日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)，是由乙型脑炎病毒引起的一种中枢神经系统疾病。该病可以感染人和多种动物，并造成不可逆的神经损害。2006年在我国山西运城发生流行性乙型脑炎，造成60人感染，其中19人死亡，社会影响巨大。在动物的感染中，猪群最易感染，怀孕母猪可表现为流产、高热、死胎，公猪则出现睾丸炎，给养殖业造成了巨大的经济损失，因此日本乙型脑炎成为严重的公共安全问题。到目前为止，还没有针对JEV的特异性治疗药物，所以，寻找治疗JEV的药物和方法是非常必要的。 JEVNS3蛋白酶在JEV多聚蛋白水解过程中起着重要的作用，是乙型脑炎病毒复制所必需的。因此NS3蛋白酶已经被很多研究者们所关注，成为一个治疗乙型脑炎的潜在药物靶标。目前针对HCVNS3蛋白酶为靶标已筛选出药物特拉匹韦(telaprevir,VX-950)和波普瑞韦(boceprevir,SCH-503034)，然而针对JEV蛋白酶抑制剂的研究几乎还没有报道。 本研究大量纯化了可溶性的JEVNS3蛋白酶，并且用荧光共振能量转移方法(FRET)检测了此蛋白酶的活性，在此基础上建立了高通量筛选方法。对实验室保存的化合物库进行筛选，得到能够抑制JEVNS3蛋白酶活性的10种小分子化合物，但通过在细胞水平上验证可知，有两种化合物能很好的抑制JEV的增殖。将筛选到的10种阳性化合物在WNV和DENVNS2B/NS3蛋白上验证，结果表明，有两种化合物对WNV和DENVNS2B/NS3蛋白分别有较好的抑制作用。本研究为黄病毒属病毒的预防和治疗提供了2种具有发展潜力的先导化合物。主要实验结果如下: 1.NS2B/NS3蛋白酶的纯化、活性检测及高通量筛选条件的确定 通过Ni2+-亲和层析方法纯化到JEV、WNV、DENVNS2B/NS3蛋白，SDS-PAGE鉴定可知，三种蛋白的纯度比较高。用FRET方法检测JEVNS2B/NS3蛋白酶的活性，并算得S/B=10.07和Z=0.924，符合高通量筛选要求，可用来筛选化合物库。 2.蛋白酶抑制剂的高通量筛选 对实验室保存的含有4160个小分子化合物的碎片库进行筛选。分析初筛结果，去掉本身带荧光的假阳性化合物和加样误差造成的假阳性化合物，最终得到抑制率在80％～100％之间的10种小分子抑制剂。复筛的结果再次证实了这10种小分子化合物对JEVNS3蛋白酶的抑制效果。进一步将这10种化合物在WNV和DENVNS2B/NS3蛋白上验证，结果显示，AG-690/40639011、AC-907/25005011两种化合物对WNV和DENVNS2B/NS3蛋白分别有一定的抑制作用。 3.细胞水平上验证化合物抗病毒活性 将上述10种化合物在BHK-21细胞上验证，每个化合物倍比稀释成100μM、50μM、25μM、12.5μM四个浓度。结果表明，10种化合物中，有6种对细胞毒性很大，与细胞作用的第一天就使细胞全部死亡;两种对JEV抑制效果不好;AG-690/40639011、AC-907/25005011两种化合物在细胞水平上能很好的抑制JEV的增殖。通过间接免疫荧光试验和Western blot检测JEV蛋白表达量的变化，从而验证AG-690/40639011、AC-907/25005011两种化合物的抗病毒效果。结果表明，加入化合物的实验组与对照组相比，JEV的蛋白表达量下降，并随着化合物浓度的升高蛋白表达量降低，说明两种化合物具有良好的抗病毒效果。 4.JEVNS3蛋白酶单克隆抗体的制备 使用纯化的JEVNS3蛋白酶去免疫六周龄的小鼠，通过细胞融合与间接ELISA筛选后，最终得到3株能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞:2E3、2C10、3C4。通过Western blot和间接免疫荧光分析可知，得到的针对JEVNS3蛋白酶的3株单抗都有很好的特异性。