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背景:青光眼(glaucoma)为一种常见不可逆的致盲性眼病,主要表现为特征性的视神经损害和视野缺损,其视神经损害主要表现为:神经节细胞丢失,盘沿变窄,视盘凹陷[1]。药物、小梁网激光成形、周边虹膜激光成形、周边虹膜激光切开以及滤过性手术等是目前控制眼压的主要治疗方法,药物及激光等治疗后疗效不佳时滤过性手术是目前控制眼压的重要方法,但术后2年的失败率可达15%-25%,其主要原因归结于滤过泡区纤维化病变[2-3]。术后成纤维细胞转分化以及细胞外基质过度交联是导致滤过泡发生纤维化的两个主要因素,人眼Tenon’s囊成纤维细胞在这一病程中起到重要的作用[3-6]。TGF-β具有多种生物活性的细胞因子,几乎表达于所有的组织和器官,不仅在细胞生长、胚胎组织发育、血管的形成、器官的形成以及免疫反应等发挥重要的生理作用,还是参与创伤后组织愈合及瘢痕化过程中的关键因子[7-10],大量的研究表明细胞释放的TGF-β能刺激成纤维细胞迁移、增殖、转分化,进而促进胶原蛋白的合成与沉积,其活化程度与瘢痕形成高度相关[10-12]。研究表明TGF-β2在抗青光眼滤过术后滤过泡区纤维化病理过程中起着关键性作用,其活化程度与瘢痕形成密切相关[13-15]。赖氨酰氧化酶家族(Lysyl oxidases,LOXs)是一类重要的细胞外基质蛋白酶,催化胶原与弹性蛋白之间交联[16-18]。当创伤或者炎症存在时,LOXs会过度的表达,促进胶原和弹性蛋白之间过度交联,进而交织成稳定的网状结构,从而发生渐进性瘢痕化病变[19-20]。目前大家公认TGF-β是LOXs酶的重要上游因子,可诱导细胞或组织过度表达LOXs[21-24]。因此,研究LOXs在纤维化病变中的作用,并且阻抑LOXs酶作用以达到抗瘢痕化,这一研究可为抗瘢痕化的治疗提供新的思路。本课题组前期研究的靶向TβRⅡ核酸适配子s58,已被证明可抑制人眼Tenon’s成纤维细胞转分化[25-26]。然而s58是否还可以通过抑制LOXs蛋白酶从而抑制细胞外基质未被系统的研究过,这将在本研究中进一步证实。通过本研究,可进一步认识青光眼滤过术后滤过泡纤维化的发病机制,在完善抗青光眼术后纤维化药物s58的功效研究方面具有重要意义。目的:本研究拟在体外实验观察靶向TGF-βⅡ型受体的核酸适配子s58对体外培养的H T Fs表达LOX家族蛋白表达的影响。方法:1.HTFs(Human Tenon fibroblasts,HTFs)由本课题组前期原代培养,小儿斜视术中取出多余的人眼Tenon’s囊组织,贴壁法分离培养的HTFs传代而来,本课题组前期研究得到第三军医大学大坪医院野战外科研究所伦理委员会批准[医研伦审第(2010)010号]。MTT法检测细胞活性。2.细胞免疫荧光法检测HTFs中LOX家族蛋白的分布及表达情况。3.TGF-β2(4 ng/ml)诱导HTFs 24 h,应用Western blot检测细胞LOX家族蛋白表达情况;共聚焦细胞免疫荧光技术检测HTFs中LOX蛋白定位和表达。4.不同浓度的TGF-β2(0、2、4、8、16ng/ml)作用于细胞24h后,western blot测定LOX、LOXL1、LOXL 2、LOXL 3、LOXL 4蛋白表达水平,找出LOXs表达随TGF-β2浓度变化的规律。5.使用上一步中找出的最适TGF-β2浓度(4ng/ml)作用于细胞不同时间(0h、6h、12h、24h、48h),western blot测定LOX、LOXL1、LOXL 2、LOXL 3、LOXL 4蛋白表达水平,找出刺激LOXs表达的时间变化规律。6.靶向TβRⅡ核酸适配子s58(100n M)预刺激细胞1h,与TGF-β2(4ng/ml)共刺激细胞24h,western blot测定LOX、LOXL1、LOXL 2、LOXL 3、LOXL 4蛋白表达水平,从而反映加入s58后TGF-β2对LOXs表达影响的变化。结果:1.LOXs表达于人眼Tenon’s囊成纤维细胞中,且TGF-β2促进LOXs蛋白的表达。2.TGF-β2促进人眼Tenon’s囊成纤维细胞表达LOXs蛋白具有一定的浓度依赖性,LOX、LOXL2及LOXL3蛋白表达总体随TGF-β2浓度的升高而增加,呈一定的浓度依赖性。LOXL1、LOXL4随着TGF-β2浓度的升高而有一定的增加,但没有明显的浓度依赖性。3.TGF-β2促进人眼Tenon’s囊成纤维细胞表达LOXs蛋白具有一定的时间依赖性,6h既有LOXs蛋白的表达上调。LOX随着作用时间延长表达增强,24h此效应达到饱和状态;LOXL1蛋白表达12h此效应逐渐下降;LOXL3蛋白表达12h此效应达稳定状态;LOXL4蛋白表达24h此效应逐渐下降,LOXL2表达呈持续增强趋势,随着浓度逐渐升高其表达量明显上调。4.核酸适配子s58具有明显抑制TGF-β2诱导HTFs表达LOXs蛋白的作用。结论:1.赖氨酰氧化酶家族(LOXs)表达于人眼Tenon’s囊成纤维细胞中。2.TGF-β2可促进人眼Tenon’s囊成纤维细胞中LOXs蛋白的表达,且呈现一定的浓度和时间依赖性。3.S58可明显抑制TGF-β2诱导HTFs表达LOXs蛋白的分泌。