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本文以光合细菌产氢为研究对象,对其在实验室规模上作了初步的理论研究,主要结论如下：
1.从猪粪发酵活性污泥中分离得到1株高效产氢菌株PB-a。参照《伯杰氏系统细菌学手册》第9版,经形态学、生理生化特征分析,与红假单胞菌相符合。基于16S rDNA构建的系统发育树显示,菌株PB-a和Rhodopseudomonas palustris S55聚为一个分支,两者遗传距离非常近。通过同源性序列多重比对和进化树分析结果确定该菌株归于沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。
2.以筛选得到的高效产氢菌PB-a(沼泽红假单胞菌)为研究对象,较系统地探讨了pH、温度以及光照强度等环境条件、微量元素、氮源、碳源以及其它矿质元素对PB-a菌株的生长、产氢过程的影响,并运用正交实验方法对PB-a的产氢培养基进行了优化,得出了最适宜其生长和产氢的培养条件。培养基各元素单因子实验结果方差分析显示,除CaCl2外,其它所有成分均对实验结果产生显著性影响。正交实验得出,最适宜PB-a菌株产氢的培养基组成为(g/L)：乙酸钠40 mmol/L,谷氨酸钠15 mmol/L,MgSO4 0.3,NaCl 0.4,KH2PO4 0.2,K2HPO4 0.6,NaHCO3 0.756,微量元素溶液1 mL。微量元素影响的正交试验结果表明,Fe、Mo、Mn和Ni 4种元素对PB-a菌株光合产氢的效果有显著影响,依次为Fe>Mo>Mn>Ni。其他元素在所设范围内对产氢都有一定的促进作用,因此微量元素溶液配方仍为(g/L)：FeSO4·7H2O 2,ZnCl2 0.1,MnCl2·4H2O 0.1,H3BO4 0.1,COCl2·6H2O 0.1,NiCl2·6H2O 0.02,Na2MoO4·2H2O 0.75,CuCl2·2H2O 0.01。对影响PB-a生长以及产氢环境条件的实验结果表明,光强4000 lux、初始pH 7、温度30℃最适宜该菌株的产氢。综合各个因素的最佳条件,PB-a菌株在100 mL培养体积中,最高可产氢总量为140.33 mL,最大平均产氢速率达20.9 ml/h/g(cdw),最高产氢速率为30 ml/h/g(cdw),底物最大转化率为38.9％。
3.研究了菌株PB-a在产氢过程中固氮酶、吸氢酶活性和放氢活性的变化。结果表明,固氮酶活性和菌株放氢活性变化趋势相一致,在第3至4 d的快速产氢期,活性骤然升高,之后开始缓慢下降,维持一段时间后,固氮酶活性保持在很低水平,而放氢活性基本消失。
而氢酶的吸氢活性表现为随着时间推移,慢慢呈上升趋势。综合这三者的活性变化,基本与整个反应体系中总产氢历程和产氢量的变化相符合。对菌株PB-a产氢过程中的细胞全蛋白作了SDS-PAGE分析,展示了其在时序上的表达情况,结果显示其在组成和量的表达差异上变化不大。微量元素Fe、Mo和Ni是固氮酶和氢酶的组成元素,因此对菌株的产氢影响较大。通过对不同元素缺乏情况下细胞全蛋白分析表明,蛋白在不同培养条件下,表达组分和表达量都有明显差异,为以后研究产氢工程菌提供了一定的基础。
4.利用DGGE技术监测混合光合产氢反应器中群落结构的动态变化。V3-16S rDNA的DGGE图谱反映了产氢系统中总体群落结构不同时段的多样性变化。从图谱分析可见,总体菌群在数量上变化不大,但是在组成上却发生了很大的变化,图谱中始终存在、并保持相当强度的条带代表了产氢主体—光合细菌。pufM基因的DGGE图谱反应了产氢系统中无氧光合细菌多样性的动态变化。两者的图谱比较分析显示,后者较前者显示的群落多样性更为复杂,表现为条带数目的增加和结构的复杂化。其中对典型克隆的割胶同收和测序分析表明,Rhodopseudomonas palustris是产氢系统中主要的1种优势产氢光合菌,在数量上始终保持着一定的优势。对总的菌群结构和关键的无氧光合细菌多样性变化分析表明,在生物制氢反应器中不同微生物种群具有协同和制约的复杂生态学关系,在制氢反应器不同状态运行下具有时间和空间的组合效应,在特定生态位条件下具有种群功能综合特征效应。