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海洋红酵母Rhodotorulabenthica富含氨基酸、维生素和以虾青素为主的类胡萝卜素等多种营养物质,尤其重要的是能与鱼虾贝共生,一般不致病,且具有耐盐性能在高盐条件下生长良好。海洋红酵母在医药、食品、化工和农业等方面得到了越来越广泛的重视。如果能通过基因工程手段构建一种可以表达和分泌外源基因产物的海洋红酵母工程菌,该外源基因产物是能抑杀病原菌微生物的抗菌肽、乳菌肽和溶菌酶等,从而把海洋红酵母作为一种益生菌应用于水产养殖,减少抗生素等药物的使用。这对于解决当前水产养殖面临的药物残留超标等安全质量问题具有重要的现实意义。
抗菌肽具有广谱的抗细菌活性,同时还具有高效的抗真菌、抗病毒和抗肿瘤活性:而且由于其不易产生耐药性和作用对象选择性,抗菌肽是一种未来可望代替抗生素的安全药物。抗菌肽在转基因植物、水产养殖业、人类及动物健康、疾病防治等方面已经体现了其重要的应用前景。
本研究采用PCR技术从海洋红酵母中克隆应用于表达载体构建的元件,26SrDNA同源重组序列,并进行测序分析,确定其酶切图谱后定向克隆到载体pTEF1/Zeo中,得到重组载体pTEF1/Zeo-2rDNA。
根据genebank公布的红酵母Rhodotorula的偏爱密码子设计α-Factor信号肽基因和抗菌肽CMIV基因,并人工合成这两段基因的序列,得到393bp的SA序列,测序后,将其按正确的阅读框架定向克隆在重组载体pTEF1/Zeo-2rDNA的多克隆位点上,构建成海洋红酵母分泌型表达载体pTEF1/Zeo-2rDNA-SA。
表达载体pTEF1/Zeo-2rDNA-SA经过ApaI/NarI酶切线性化处理后,电击转化海洋红酵母感受态细胞,通过Zeocin抗生素筛选、PCR鉴定阳性克隆。PCR产物测序结果正确,表明外源DNA已成功地整合到海洋红酵母基因组中。
本实验还通过一系列的参数调整,优化了载体pTEF1/Zeo-2rDNA-SA对海洋红酵母的电转化条件:当采用对数生长中期(OD600值为1.2-1.4)的菌体制备感受态细胞、电压为900V、质粒浓度为20μg/ml和电转化杯为0.2cm时,转化率达到最大值,为52个转化子/μg质粒DNA。首次建立了外源基因在海洋红酵母中的转化。