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MITF——小眼畸形相关转录因子，是一个基本-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(bHLH-Zip)转录因子，通过结合启动子CATGTGA序列调控TYR基因和其他黑色素细胞特异性基因的表达。MITF参与黑色素细胞的发育和黑色素的合成。人类中，MITF突变会导致Ⅱ型瓦登伯格综合征。瓦登伯格综合征是一种罕见的听力-色素缺陷的遗传病，人群发病率为1/42，000。根据临床表现，可将瓦登伯格综合征分为4个型，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，其中Ⅱ型除基本症状（肤色白化、虹膜浅染、听力缺失）外无其他症状。MITF突变导致约15％的Ⅱ型瓦登伯格综合征病例。 本课题组在前期研究中利用ENU诱变技术，于2012年筛选得到一头表型与人类Ⅱ型瓦登伯格综合征相似的广西巴马小型猪公猪，以其为家系公猪进行家系组建（1202101家系），并验证表型的遗传性和遗传模式，发现突变体表型可遗传且遗传模式为常染色体显性遗传。通过全基因组关联分析结合连锁分析和候选基因法，发现MITFc.740T＞C(p.L247S)突变。为了验证MITFL247S突变是否就是1202101家系的致病突变，对MITFL247S突变进行功能学研究。 通过病理学切片的方法，对突变个体表型发生的主要器官皮肤、眼睛、耳蜗进行病理学研究。皮肤病理学切片结果显示，和MITF+/+猪相比，MITF+/L247S和MITFL247S/L247S猪表皮和毛囊色素缺失。眼睛病理学切片结果显示，和MITF+/+猪相比，MITF+/L247S猪的眼睛结构、形态没显著性变化，而MITFL247S/L247猪眼睛色素上皮色素缺失和视网膜发育异常。耳蜗病理切片结果显示，和MITF+/+猪相比，MITF+/L247S和MITFL247S/L247猪耳蜗血管纹变薄、毛细胞发育异常、盖膜异常。结果表明，突变个体表型发生机制是黑色素细胞缺失或功能缺陷。 利用半定量RT-PCR技术，对突变个体表型发生的主要器官皮肤、眼睛、耳蜗进行黑色素细胞发育和色素合成相关基因表达水平检测，选择的基因包括SOX10、PAX3、MITF、TYR、TYRP1、DCT、PMEL、MC1R，MITF作为黑色素细胞关键调控因子，受SOX10、PAX3的转录调控，然后调控下游TYR、TYRP1、DCT、PMEL、MC1R的转录。半定量RT-PCR结果显示，皮肤和耳蜗中，和MITF+/+猪相比，MITF+/LS247S猪和MITFL247S/L247S猪的MITF和 SOX10表达水平没有明显差异，PAX3、TYR、TYRP1、DCT、PMEL、MC1R表达都出现明显降低。眼睛RT-PCR结果显示，和MITF+/+猪相比，MITF+/LS247S猪的SOX10、MITF、DCT、PMEL、MC1R表达水平没有明显的差异，而PAX3表达出现明显降低，TYR、TYRP1表达也出现降低。结果表明，MITFL247突变没有影响MITF自身的表达，但影响MITF对下游基因的转录，进而影响黑色素细胞的发育和功能。 构建MITF-GFP表达载体，通过免疫荧光手段，检测L247S突变是否影响MITF蛋白的亚细胞定位。免疫荧光结果显示，MITF野生型蛋白仅分布于细胞核中，而MITFL247S突变蛋白在细胞核和细胞质中都有分布。结果表明，L247S突变影响MITF蛋白的亚细胞定位，暗示着L247S突变影响MITF蛋白功能的发挥。 构建TYR启动子-荧光色素酶报告载体，利用双荧光色素酶报告基因检测系统，在细胞水平上验证L247S是否影响MITF的转录活性。此外，共转野生型表达载体和突变型表达载体，验证杂合突变体的发病机制。检测结果显示，MITF野生型蛋白有效激活TYR启动子转录，提高TYR启动子的活性约70倍，而MITFL247S突变蛋白并没有介导TYR启动子激活。MITF野生型载体和MITFL247S突变型载体共转的检测结果显示，随着MITFL247S表达量的增加，TYR启动子活性没有出现显著性差异。结果表明，MITFL247S突变蛋白是功能缺失蛋白，不能诱导靶基因的转录;MITFL247S突变蛋白对野生型蛋白功能发挥不造成影响，MITF+/LS247S猪的发病机理是MITF单倍剂量不足。 有研究发现，在人类中，出现SOS1等位基因表达不平衡的现象，猜测广西巴马小型猪中MITF的表达是否也出现这种情况。利用T载体克隆技术，对MITF+/LS247S猪的皮肤、耳蜗和眼睛的cDNA上c.740位点的T和C表达量进行统计。统计结果显示，皮肤、耳蜗和眼睛中突变c.740C的表达量显著高于野生型c.740T的表达量，c.740C的表达量约为c.740T的两倍。结果表明广西巴马小型猪中存在MITF等位基因表达不平衡性。 目前，对MITF和黑色素细胞的研究发现，在神经嵴向黑色素细胞分化的最初，MITF基因已经开始表达，MITF影响黑色素细胞的分化和发育。为了研究MITF对猪胚胎发育早期的影响，利用转录组测序技术，以期建立第18天猪胚胎野生型个体和MITF突变个体的差异表达谱。测序结果显示，在猪胚胎第18天时，MITF已经开始表达。比较野生型个体和突变个体差异表达的基因，找到416个突变体/野生型上调的基因，48个突变体/野生型下调的基因，这些基因参与早期胚胎发育，主要富集于血液凝集通路和Wnt信号通路。结果表明，MITF在18天胚胎已经开始发挥功能，此时的功能主要与血液凝集通路和Wnt信号通路有关。转录组测序结果还需进一步分析验证。 经过一系列功能学研究，可初步证实MITFL257S是1202101家系突变体的致病突变，并且研究结果可以为该家系突变猪作为人类Ⅱ型瓦登伯格氏综合征疾病模型的应用提供参考。