论文部分内容阅读
背景和目的: 子宫颈癌是女性恶性肿瘤，其发病率在女性生殖道肿瘤中高居首位，每年新发病例约52.9万，死亡病例27.5万，约85％发生在发展中国家[1]。近几年，我国子宫颈癌的发病率有明显上升及年轻化的趋势，发病率以每年2%~3%的速度增长。子宫颈癌治疗后复发50%发生在一年内，75%~80%发生在2年内，严重影响着宫颈癌患者的生存时间。临床常规物理诊断手段(如核磁共振、超声等)发现小于1cm的微小病灶很难，而传统肿瘤标志物的灵敏度和特异性也不够高；患者常因非个体化治疗遭受多次不必要的放化疗痛苦，故临床上子宫颈癌诊断和治疗最迫切的问题还在于缺乏早期诊断和监测疾病复发、转移、判断预后以及指导个体化治疗的可靠指标。 长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是非编码RNA中的一种类型，即国际上认定的一种长度大于200个核苷酸的 RNA转录本（基于 RNA的分离及提取程序以200个核苷酸划界）[2]，不具有编码蛋白质的功能，主要作为诱饵分子、引导分子、骨架分子及增强子参与多种调控机制[3]，在转录水平、转录后水平以及表观遗传水平（如染色质重塑、组蛋白修饰）调控基因表达。大多数lncRNA含有高度保守的近端启动子序列、外显子、内含子及二级结构，这意味着lncRNA不是基因转录中的“噪音”[4]，相反，lncRNA在细胞周期改变、增殖、迁移和代谢等方面发挥了重要作用[5,6,7]。近年来，随着全基因组微阵列及高通量测序技术的快速发展及广泛应用，人类基因组内越来越多的lncRNA被鉴定出来，lncRNA所介导的复杂网络调控着数量众多的编码基因，因此，lncRNA在肿瘤学研究中具有重要意义，寻找lncRNA分子及其靶基因的研究，已成为基因调控和肿瘤学研究领域的热点及重要分支。 基因表达谱分析是指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库，经基因芯片进行大规模cDNA测序，从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息，这样编制成的数据表就称为基因表达谱。基因芯片技术是目前研究lncRNA表达谱的一种理想有效的方法，已广泛应用于多种肿瘤相关的lncRNA差异表达谱分析，例如，骨肉瘤差异表达谱，乙肝相关性肝癌差异表达谱等分析。研究肿瘤基因表达谱、选取信息基因是从信息学角度出发寻找肿瘤相关基因、发现肿瘤基因表达特征的直接手段。 目前，有关lncRNA与宫颈癌的研究，国内外主要是通过检测某些已经研究较成熟的 lncRNAs在宫颈癌及其细胞系中表达水平上的差异，及该差异与临床病理因素的关系来得出它们与宫颈癌发生发展相关，少数对小样本进行芯片检测，表明宫颈癌发生发展过程中存在与疾病相关的lncRNAs，但由于其采用芯片含盖lncRNA数据不全面及检测样本量少，缺乏代表性，尚未研究出有临床诊断及治疗价值的lncRNA分子。 本课题采用博奥生物集团有限公司提供的一款涵盖 lncRNA序列最新最全面的lncRNA芯片——晶芯4x180k lncRNA V3.0检测芯片，在14对宫颈鳞癌组织及其相应癌旁正常组织中检测lncRNA基因差异表达谱，其目的意义在于：从基因水平寻找病因，分析宫颈癌中lncRNA基因表达特征，发现与宫颈鳞癌致病过程相关的lncRNAs，为今后靶lncRNA基因的筛选缩小范围，为lncRNA进一步功能及作用机制的研究奠定基础，从而最终寻找出宫颈癌中特有的新的生物学标志物，探索出新的诊断与治疗途经。 材料与方法: 一.检测子宫颈癌组织与其相应癌旁正常组织lncRNA差异表达谱 ⒈分别取14例子宫颈鳞癌组织和相应癌旁正常组织，病理快速冰冻确定分组，用Trizol试剂法提取总RNA，用NanoDropND-2000型紫外分光光度计、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳法及 Aglient2100生物芯片分析仪进行提取RNA质量检测。 ⒉质量检测合格后，在博奥生物集团有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心的协助下，采用由该公司提供的晶芯4x180k lncRNA V3.0检测芯片进行杂交反应，经过Agilent芯片扫描仪（G2565CA）扫描后得到原始数据，原始数据由该公司经 Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据，然后使用 Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析，计算基因表达差异和统计学显著性P值。本课题所采用芯片是博奥公司借助Agilent芯片制备平台推出的一款 lncRNA芯片，以 GENCODE/ENSEMBL最新版本的22444条序列信息为基础，整合了 Refseq、UCSC、H-InvDB、Human lincRNA catalog、NRED、lncRNAdb、RNAdb等13个主要lncRNA数据库及相关文献报道的序列，同时也包含中科院生物物理所陈润生院士研究组发现的约848条中等长度的非编码RNA，是目前涵盖 lncRNA序列最新最全面的一款芯片，并且可同时对mRNA进行检测，包括约3.7万条lncRNA和约3.4万条mRNA检测的探针。该芯片采用Agilent原位合成方式，设计为60mer的长寡核苷酸探针，检测探针均重复2次或以上，兼顾高严谨杂交条件下高灵敏度及高特异性检测效果，性价比高。 ⒊以Folgchange值>2，并且P≤0.05作为差异基因纳入标准，采用折叠倍率(Fold Change)法进行差异基因筛选，获得差异lncRNAs和mRNAs表达谱，通过散点图(Scatter Plot)和火山图(Volcano Plot)对差异lncRNAs和mRNAs进行直观标示，然后再采用Cluster3.0软件对数据进行聚类分析； 二.SYBR GREEN I实时荧光定量PCR验证lncRNAs差异表达谱 从差异表达倍数前20、基因表达量前20的 lncRNA差异表达谱中，选取lncRNA基因中含有内含子的9个lncRNAs，其中上调lncRNA4个：uc001ysg.1， ENST00000558982.1，ENST00000444286.1，ENST00000460164.1，下调lncRNA5个：ENST00000418923.1， ENST00000502334.1， ENST00000537998.1， ENST00000414515.2，uc009zbb.1，采用 SYBR GREEN I实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative PCR，RT-PCR)在随机选取的5对组织样本中进行验证，并用GAPDH做内参，进一步明确lncRNA基因芯片的准确性。结果 ⒈子宫颈癌癌灶组织与相应癌旁正常组织相比，在检测的lncRNA表达谱中，差异 lncRNAs有1457个，其中平均上调的 lncRNAs有694个，平均下调的lncRNAs有763个，uc001ysg.1是上调倍数最大的lncRNA，上调倍数为8.337529， ENST00000418923.1是下调倍数最大的 lncRNA，下调倍数为6.6592875；同时检测所得的差异mRNAs共有2223个，其中平均上调的mRNAs有1624个，平均下调的mRNAs有599个，NM_005733是上调倍数最大的mRNA，上调倍数为9.013323，NM_001242607是下调倍数最大的mRNA，下调倍数为6.6107173。 ⒉实时荧光定量PCR结果显示uc001ysg.1（P=0.04），ENST00000558982.1（P=0.031），ENST00000444286.1（P=0.035），ENST00000460164.1（P=0.025）这4个基因表达显著上调, ENST00000418923.1（P=0.012），ENST00000502334.1（P=0.025），ENST00000537998.1（P=0.043），ENST00000414515.2（P=0.013）， uc009zbb.1（P=0.007）这5个基因表达显著下调，差异均有统计学意义（P<0.05），和芯片结果基本吻合。 结论: 1.晶芯lncRNA V3.0芯片是检测子宫颈癌差异表达基因的一种快速、高效、高通量的检测手段； 2.芯片结果表明在子宫颈癌中存在异常表达的lncRNA基因，利用实时荧光定量 PCR对芯片结果进行验证，进一步提高了芯片结果的可信度，说明这些lncRNAs参与了宫颈癌多种恶性表型的调控过程； 3.表达谱中 uc001ysg.1、ENST00000558982.1、ENST00000444286.1、ENST00000460164.1、ENST00000418923.1、ENST00000502334.1、ENST00000537998.1、ENST00000414515.2、uc009zbb.1差异表达明显，可能与宫颈癌的疾病发生发展密切相关，可能是全新的子宫颈癌标记物，并且可能是潜在的基因治疗靶点。