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狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染引起的高致死性人兽共患传染病，一旦出现临床症状，死亡率几乎100%。RABV属于单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组主要编码5种结构蛋白。近年来随着负链RNA病毒反向遗传学的发展，不同毒株狂犬病病毒的反向遗传操作系统也相继被建立。基于反向遗传操作系统的狂犬病病毒载体也被广泛用于新型疫苗的研制和神经示踪等研究。狂犬病病毒SRV9株是我国研究者将狂犬病病毒SAD株在BHK细胞上通过空斑克隆筛选出的弱毒疫苗株，对多种动物无致病性，且具有免疫原性好等优点。因此，建立狂犬病病毒SRV9株反向遗传操作系统，并利用其构建与筛选新型安全、高效狂犬病疫苗对于我国狂犬病的综合防控具有重要意义。此外，也可以以此构建新型病毒载体用于其它疫病新型疫苗研究。为分析狂犬病病毒SRV9株全长基因组序列，通过Primer Premier V5.0软件对SRV9株全长基因序列设计13对测序引物，分别PCR并连接到pEASY-Blunt载体后进行序列测定。测序结果与网上公布序列一致。通过DNAStar软件分析SRV9株全长基因序列，利用单一酶切位点，将全长cDNA分为相互重叠的四段，根据重叠区域的酶切位点拼接全长。并且通过PCR方法分别在全长的3′端和5′端引入锤头状核酶HamRZ和乙肝丁型核酶HdvRZ序列，以pCI和pcDNA3.1(+)载体为基础，构建全长真核表达质粒pCI-SRV9和pD-SRV9。同时分别以pCI和pcDNA3.1(+)载体为基础，构建分别表达SRV9株N、P、G、L蛋白的辅助质粒：pCI-N、pCI-P、pCI-G、pCI-L；pD-N、pD-P、pD-G、pD-L。在表达载体构建过程中，起始密码子前增加了可增强蛋白表达的Kozak序列，终止密码子后增添了额外的终止密码子，用以有效终止转录。分别将pCI-SRV9或pD-SRV9与相应的辅助质粒通过脂质体LipofectamineTM2000共转染BSR细胞并拯救重组病毒，其中全长质粒与辅助质粒N、P、L、G的使用量依次为2.5μg、0.625μg、0.3125μg、0.125μg、0.1875μg。结果表明，两种质粒表达系统均可拯救到有感染活性的病毒，且pD-SRV9表达质粒的拯救效率（8/8）远高于pCI-SRV9表达质粒（3/30）。对拯救获得的重组病毒进行体外生物学特性分析，结果表明：拯救获得的重组病毒在BSR、NA细胞上的生长性能与野生型SRV9无明显差异（p>0.05）。通过PCR方法在狂犬病病毒SRV9株基因组的P与M基因间引入外源基因表达元件，根据引入元件的具体位置不同，构建了两种外源基因表达载体：第一种为在P基因的终止密码子后、P基因的转录终止信号poly A前引入外源基因表达元件PE-PS-BsiWI-PmeI，命名为pD-SRV9-PM-eGFP；第二种为在P基因的转录终止信号polyA后、M基因的转录起始信号前引入外源基因表达元件PS-BsiWI-PmeI-PE，命名为pD-SRV9-sPM-eGFP。其中PE、PS分别为模拟的SRV9株P基因的转录终止信号TGAAAAAAA和转录起始信号AACACCCCT。将eGFP作为指示目的基因插入上述两种表达载体的相应酶切位点间构建表达eGFP的全长质粒。将两种表达外源基因的全长表达质粒与辅助质粒共转染BSR细胞，结果均可成功拯救到表达eGFP的重组狂犬病病毒，两者的拯救效率无明显差异，获得的2种表达eGFP的重组病毒在体外的生长特性无显著差异，且与野生病毒也无显著差异，即外源基因eGFP的插入和表达不影响重组狂犬病病毒的体外生长特性。本研究成功构建了狂犬病病毒SRV9株反向遗传系统，并研制了可表达外源基因的重组狂犬病病毒载体，为进一步研究RABV的致病机理、研制狂犬病新型疫苗或开发以RABV为载体的其它疾病疫苗奠定基础。