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背景与目的结直肠癌是危害人类健康的恶性肿瘤之一。近年来呈现逐年增长的趋势。目前结直肠癌的治疗仍无有效的治疗方法,传统的手术治疗具有疗效慢,创伤大等弊端,以致近年来结直肠癌患者的生存率没有显著提高。分子生物学的发展为肿瘤的治疗带来了希望。以肿瘤基因为靶向的基因治疗有望为肿瘤等恶性疾病的治疗翻开崭新的一页。目前兴起的RNA干扰技术,为肿瘤相关基因的功能研究、靶向基因治疗的研究提供了可以利用的方法。因此选择好基因的靶点将是基因治疗的关键所在。肿瘤的发生涉及多种基因,是一个庞大复杂的调控网络。LEF-1基因位于人染色体4q23-4q25, mRNA开放阅读框(ORF)大小为1200 bp,其基因组序列至少跨距140 kb,含有12个外显子及11个内含子,其中有一个大的第3个内含子(75 kb)可能含有可选择性的外显子。LEF-1是一个多启动子基因,第一个启动子转录全长LEF-1 mRNA,编码具有β-catenin的结合区的产物,第二个启动子转录截短形式的LEF-1,缺乏β-catenin的结合区,具有Wnt信号的负向调控作用。它与肿瘤的发生发展,侵袭转移密切相关。LEF-1作为LEF/TCF家族的成员之一,通过募集转录激活因子β-catenin到靶基因介导Wnt信号通路。Wnt致癌的关键是β-catenin不能被降解,胞内过多β-catenin入核并与LEF/TCF结合,激活下游靶基因c-myc、cyclin-D1、astrin、survin、VEGF、ASEF的转录,导致肿瘤的发生。因此,阻断异常的Wnt信号通路,可以抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞的凋亡。LEF/TCFs-β-catenin作为Wnt信号通路的最终效应物,将是抗癌治疗的重要靶点。针对LEF/TCF上β-catenin的结合位点开发出小分子药物封闭特异的信号分子,是分子水平治疗肿瘤有效策略。随着技术的革新,人们陆续发现了许多新的基因,因此对基因功能的研究方法越来越多,RNAi成为研究特定基因的特效工具,其在分子学领域具有巨大的应用前景。RNAi具有操作敏捷、陈本低、高效、周期短、高特异性等优点,目前可以应用于几乎所有的基因序列。因此,RNA干扰技术在肿瘤的诊断及治疗方面具有潜在的广阔前景。本论文在结合国内外RNAi研究基础上,针对LEF-1基因三种变异体,设计靶向该基因的三条干扰序列,以人结直肠癌Caco-2细胞株为实验材料,运用RT-PCR、Western blot、Hoechst33258染色、MTT法以及体外损伤修复法等方法,研究LEF-1基因被干扰后mRNA水平、蛋白表达水平的变化、细胞凋亡形态学变化、增殖及迁移能力的变化等方面的影响。方法1.在GenBank中搜索人LEF-1基因各变异体的mRNA序列,按照siRNA设计原则,设计优化出三条靶向LEF-1的干扰序列和一条阴性错义对照序列。合成这些序列,将这些序列克隆至载体Pu6.1-GFP。2.摸索出新的转染试剂S-TranG,极大提高了转染效率,分组(NC, shRNASCR, shLEF1-1, shLEF1-2, shLEF1-3)并将质粒导入人结直肠癌(Caco-2)细胞株；3.以western blot分别检测转染24h、48h、72h、96h后各组LEF-1蛋白表达水平；4.以MTT、Hochast33258染色及体外损伤修复法观察分析抑制LEF-1表达后对人结直肠癌(Caco-2)细胞增殖、凋亡形态变化及体外运动能力的影响。结果1.经酶切鉴定和DNA测序证实针对LEF-1的siRNA的重组质粒载体构建成功。2.摸索出新的转染试剂S-TranG,极大提高了转染效率,(转染前细胞汇合率为60%-70%,4μg质粒用量,静置10-15分钟)把重组子高效地导入人结直肠癌细胞。3. western blotting结果显示：转染后干扰组LEF-1蛋白水平下降,转染后72h蛋白表达抑制率最高,且siLEF1-3的抑制作用相比于其它干扰组抑制效率更强。4.MTT法、Hochast33258染色法及体外损伤修复实验结果表明,三个干扰组对Caco-2细胞均有抑制效应,72h,96h细胞增殖和迁移被显著抑制(p＜0.01), Hochast33258染色结果显示,转染后96 h,干扰组观察到有凋亡特征的细胞,而阴性对照组的增殖力、凋亡及迁移能力在转染后与正常对照组均无明显差异结论通过RNA干扰技术,靶向沉默LEF-1基因在人结直肠癌Caco-2细胞中的表达,可抑制Caco-2细胞体外增殖和迁移能力,促进Caco-2凋亡；阴性对照组的增殖、凋亡及迁移能力无显著变化。通过Western blot检测,说明干扰组的蛋白表达水平明显降低。因此,LEF-1有望成为治疗结直肠癌新的靶点,并为结直肠癌的治疗提供新的依据和策略,对LEF-1基因表达的干预将有巨大的应用潜力。