论文部分内容阅读
半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族是一类能够特异性地识别天冬氨酸切割位点的半胱氨酸蛋白酶，已鉴定的哺乳动物Caspase有14种，Caspase不仅参与细胞凋亡的启动、传递和执行过程，还在细胞分化、细胞增殖和细胞迁移中发挥重要作用。目前，Caspase家族在高等脊椎动物中的研究较为深入，而最原始的无颌类脊椎动物七鳃鳗中Caspase家族分子的组成、结构及原始功能特征至今未有报道。此外，为了进一步了解Caspase家族分子的进化历程及其在不同物种中的结构特征，对七鳃鳗及多个物种Caspase家族分子进行了生物信息学分析，包括系统发育树、结构域、保守基序、基因结构和共线性，并检测了七鳃鳗组织和胚胎中Caspase家族的基因表达水平，以及病原菌刺激后Caspase的应答情况。此外，对Caspase1和7的功能特性进行了研究。总之，开展七鳃鳗Caspase家族分子的进化和功能研究不仅为阐述Caspase基因家族的进化提供了参考，而且为Caspase基因家族的原始功能研究提供了新的方向。
1.雷氏七鳃鳗基因组中共鉴定出9个含有保守CASc结构域的Caspase基因。根据功能注释和系统发育分析，它们代表了六种Caspase家族分子。其中，Caspase1、6、8、9各有1个基因拷贝，Caspase3和7分别有2个拷贝和3个拷贝。同线性分析可知，人Caspase4、5、12基因与Caspase1紧密连锁；Caspase8、10和CFLAR基因位于同一条染色体上。然而，七鳃鳗基因组中不存在Caspase4、5、10、12基因，说明这些基因是在七鳃鳗物种进化后产生。Caspase1、6、8和9则保持了相对稳定的基因组和蛋白结构。七鳃鳗中存在Caspase3、6、7凋亡执行分子，且Caspase7是脊椎动物Caspase3和7的原始形式。七鳃鳗基因内部的复制和重排引起Caspase3和7基因的扩增，具有物种特异性。
2.应用Q-PCR法测定七鳃鳗Caspases在不同组织和胚胎中的表达模式。6种Caspases分子在白细胞、卵巢、脑、鳃、心、肠、肾、口腔腺、肝、肌肉、神经轴体和睾丸中均有不同程度的表达。除了睾丸外，Caspase7在各种组织中均有高表达，而Caspase8和9的组织特异性表达谱基本相似，在白细胞、肠、口腔腺和神经轴体中均有高表达，Caspase8在鳃和心脏中较高，而Caspase9在卵巢和睾丸中较高。Caspase6在肠、肾、肝、口腔腺中均有高表达，Caspase1、3和3(2)基因在各组织中表达水平较低。与组织相比，Caspases在七鳃鳗胚胎发育过程中表达水平较低，除了Caspase1和9在原肠胚和神经胚中高表达外，其他Caspase在胚胎发育中表达水平较低或无表达。
3.Caspase家族分子对细菌的刺激产生应答，七鳃鳗Caspase1和7的表达先升高后降低再升高。金黄色葡萄球菌刺激72小时后，七鳃鳗Caspase3、6、8和9的表达仍然处于低水平。金黄色葡萄球菌和PolyI:C刺激的七鳃鳗Caspase分子在72小时内保持低表达。在这三种病原菌中，七鳃鳗Caspase1和7水平相似，变化更明显。此外，七鳃鳗重组Caspase1和7蛋白具有微生物识别和杀菌作用。Caspase1和7蛋白与LPS具有很强的结合作用。Caspase7蛋白与PGN、MDP和LTA的结合比Caspase1蛋白更强。Caspase1和7蛋白对鳗弧菌和金黄色葡萄球菌有杀伤作用，细菌活力呈剂量-时间依赖性显著下降。说明七鳃鳗Caspase1和7蛋白对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有识别和杀菌作用。
4.七鳃鳗Caspase1和7蛋白能以时间和剂量依赖的方式诱导HeLa细胞发生凋亡，并且脊椎动物的Caspase抑制剂能够抑制七鳃鳗Caspase1和7蛋白的促凋亡活性，说明七鳃鳗Caspase1和7已经具有脊椎动物Caspase1和7促凋亡活性的功能域和抑制剂识别的位点。
1.雷氏七鳃鳗基因组中共鉴定出9个含有保守CASc结构域的Caspase基因。根据功能注释和系统发育分析，它们代表了六种Caspase家族分子。其中，Caspase1、6、8、9各有1个基因拷贝，Caspase3和7分别有2个拷贝和3个拷贝。同线性分析可知，人Caspase4、5、12基因与Caspase1紧密连锁；Caspase8、10和CFLAR基因位于同一条染色体上。然而，七鳃鳗基因组中不存在Caspase4、5、10、12基因，说明这些基因是在七鳃鳗物种进化后产生。Caspase1、6、8和9则保持了相对稳定的基因组和蛋白结构。七鳃鳗中存在Caspase3、6、7凋亡执行分子，且Caspase7是脊椎动物Caspase3和7的原始形式。七鳃鳗基因内部的复制和重排引起Caspase3和7基因的扩增，具有物种特异性。
2.应用Q-PCR法测定七鳃鳗Caspases在不同组织和胚胎中的表达模式。6种Caspases分子在白细胞、卵巢、脑、鳃、心、肠、肾、口腔腺、肝、肌肉、神经轴体和睾丸中均有不同程度的表达。除了睾丸外，Caspase7在各种组织中均有高表达，而Caspase8和9的组织特异性表达谱基本相似，在白细胞、肠、口腔腺和神经轴体中均有高表达，Caspase8在鳃和心脏中较高，而Caspase9在卵巢和睾丸中较高。Caspase6在肠、肾、肝、口腔腺中均有高表达，Caspase1、3和3(2)基因在各组织中表达水平较低。与组织相比，Caspases在七鳃鳗胚胎发育过程中表达水平较低，除了Caspase1和9在原肠胚和神经胚中高表达外，其他Caspase在胚胎发育中表达水平较低或无表达。
3.Caspase家族分子对细菌的刺激产生应答，七鳃鳗Caspase1和7的表达先升高后降低再升高。金黄色葡萄球菌刺激72小时后，七鳃鳗Caspase3、6、8和9的表达仍然处于低水平。金黄色葡萄球菌和PolyI:C刺激的七鳃鳗Caspase分子在72小时内保持低表达。在这三种病原菌中，七鳃鳗Caspase1和7水平相似，变化更明显。此外，七鳃鳗重组Caspase1和7蛋白具有微生物识别和杀菌作用。Caspase1和7蛋白与LPS具有很强的结合作用。Caspase7蛋白与PGN、MDP和LTA的结合比Caspase1蛋白更强。Caspase1和7蛋白对鳗弧菌和金黄色葡萄球菌有杀伤作用，细菌活力呈剂量-时间依赖性显著下降。说明七鳃鳗Caspase1和7蛋白对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有识别和杀菌作用。
4.七鳃鳗Caspase1和7蛋白能以时间和剂量依赖的方式诱导HeLa细胞发生凋亡，并且脊椎动物的Caspase抑制剂能够抑制七鳃鳗Caspase1和7蛋白的促凋亡活性，说明七鳃鳗Caspase1和7已经具有脊椎动物Caspase1和7促凋亡活性的功能域和抑制剂识别的位点。