论文部分内容阅读
脂肪酶作为一种卓越的生物催化剂可以接受许多复杂的非天然大分子化合物作为底物并且在催化过程中有着精确的区域选择性和立体选择性。然而将脂肪酶真正应用于工业生产也存在一定的挑战:一是生产过程中脂肪酶的稳定性，二是游离脂肪酶在生产过程中不可重复利用。脂肪酶的固定化可以同时解决这两个问题。故开发新型的脂肪酶固定化载体，研究新型的脂肪酶固定化方法对拓宽脂肪酶在工业生物催化中的应用范围有着重要的理论指导意义。本研究从脂肪酶特殊的生理生化特性出发，合理的设计了固定化载体，通过简单的物理吸附对脂肪酶YCJ01进行了固定化研究，以及对固定化酶在非水相中催化乙酸肉桂酯的合成以及(R，S)-1-（2-萘基）乙醇手性拆分中的应用做了初步研究。 本研究以介孔二氧化钛纳米材料为载体，通过化学方法采用不同的硅烷偶联剂对其表面进行改性使之表面连接上不同的疏水有机官能团，采用的硅烷偶联剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷(Ap)、γ-（2，3-环氧丙氧基）丙基三甲氧基硅烷(Ep)、3-（2-氨乙基）-氨丙基三甲氧基硅烷(Ae)、十六烷基三甲氧基硅烷(He)、3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷(Ph)，经修饰后的载体分明命名为Ap-TiO2、Ep-TiO2、Ae-TiO2、He-TiO2、Ph-TiO2。采用简单的物理吸附法对BurkholderiaambifariaYCJ01脂肪酶进行固定化，通过载体表面性质对脂肪酶固定化效果的影响研究表明，经疏水改性的载体可以明显改变固定化酶的蛋白吸附量、固定化酶活力以及活力回收率等。其中经Ph-TiO2吸附后的固定化酶有着相对较低的蛋白吸附量12.83mg/g和最高的固定化酶酶活5344.32U/g，固定化酶比活力为416.55U/mg，表明该载体可以选择性的从脂肪酶发酵粗酶液中吸附脂肪酶分子。另外在固定化过程中的酶活回收率可达129.26％，推测载体表面的微环境可能触发了脂肪酶的“界面激活”效应，使得覆盖在脂肪酶活性中心上方的“lid”结构打开，从而对脂肪酶产生激活。 通过扫描电镜(SEM)、傅立叶变换红外分析(FT-IR)、N2吸附-脱附以及热重分析等手段对TiO2、Ph-TiO2、Ph-TiO2-lipase进行了表征分析，综合表征结果可以看出，介孔TiO2在表面修饰前后及固定化过程中，载体的外观没有发生改变，3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷与介孔TiO2表面羟基成功偶联且固定化过程成功实现。随后研究了固定化过程中吸附时间和温度对固定化效果的影响，结果表明最佳的吸附时间为14h，吸附温度为35℃。固定化脂肪酶YCJ01的最适反应温度为50℃，与游离酶相仿;最适反应pH为7.0，相比游离酶(7.5)更偏中性范围，并且固定化脂肪酶YCJ01较游离酶相比展现出了更好的温度和pH稳定性。 对固定化脂肪酶YCJ01在非水相中催化合成乙酸肉桂酯的反应条件作了研究，结果为4mL异丙醚体系，肉桂醇浓度400mmol/L，乙酸乙烯酯浓度2400mmol/L，加入50mg固定化脂肪酶YCJ01，40℃、180rpm条件下，反应6h，底物肉桂醇的转化率可达96.89％，相比游离酶，固定化酶可以缩短近18h的反应时间。经过10个批次的反应后，底物肉桂醇的转化率仍可以达到81.7％。 对固定化脂肪酶YCJ01在非水相中手性拆分(R，S)-1-（2-萘基）乙醇的反应条件作了研究，结果为:4mL正己烷体系，50mg固定化脂肪酶，（R,S）-1-(2-萘基)乙醇浓度180mmol/L，辛酸乙烯酯作为酰基供体，浓度为1080mmol/L，40℃、180rpm条件下，反应24h，达到理论拆分值:转化率50％，ees、eep均为99.9％，对映体选择性E＞＞200。经过10个批次的拆分反应后仍可达到转化率44.10％，ees=78.88％、eep=99.9％，E＞＞200的拆分效果。 本研究采用介孔TiO2为载体，通过对其表面进行不同疏水基团的功能化改性，制备了针对脂肪酶的专一性固定化载体，经物理吸附后，制备了固定化脂肪酶YCJ01。并将固定化脂肪酶YCJ01应用于非水相中催化酯类合成和手性药物中间体的手性拆分当中，固定化脂肪酶显示了良好的催化活性和操作稳定性。