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癫痫是小儿神经系统最常见疾病之一,主要表现为脑内局部或广泛的痫性放电引起反复、自发的痫样发作(包括痉挛或非痉挛性发作形式)。而且即使是成人癫痫,起病年龄在15岁以下者也接近50％。长期、频繁的癫痫发作可对患儿智能发育、学习记忆等造成永久性损害,因此控制癫痫发作不仅能有效改善患儿未来的工作和生活质量,也对减轻家庭和社会负担具有重要意义。随着抗癫痫新药的涌现和手术术式的改良,临床上一部分癫痫患儿经早期合理抗癫痫治疗后发作可得到有效控制,然而仍有1/3的癫痫患儿疗效难以令人满意,最终发展成为难治性癫痫(intractable epilepsy,IE),严重影响患儿的智力发育。难治性癫痫中,以颞叶内侧癫痫(mesial temporal lobe epilepsy,MTLE)最为常见,其多数起源于颞叶海马,具有复杂部分运动性发作的临床特征,多在10岁左右发病,约占全部癫痫患儿的10～30％。迄今为止,仍有大约70％的MTLE患儿经药物治疗及手术治疗均未能取得满意的疗效。因此,深入探讨MTLE的发病机制,对于寻找新的药物治疗靶点和改善患儿预后具有重要意义。已有研究表明,海马是MTLE的解剖起源,以神经元坏死、丢失和胶质增生为主要特征的海马硬化是导致MTLE普遍难治的最常见且最具特异性的病因,其中海马神经元重组以及苔藓纤维出芽,形成异常神经网络是反复自发痫性发作(spontaneous recurrent seizures,SRS)的主要环节。目前认为MTLE合并海马硬化的形成原因与婴幼儿时期的海马区各种损伤(外伤、热性惊厥、癫痫持续状态等)有关,并在经历经数月至数年的潜伏期后出现导致自发痫性发作,但其具体机制尚不明确。
当下对MTLE的研究多以成年动物模型和临床术后标本为基础,但绝大多数研究在疾病已完全形成的阶段进行,并不能反映病程中体内环境的动态性改变。而婴幼儿期神经系统损伤后所致的慢性MTLE是一个长期的动态过程,探明在此过程中引导癫痫发生的损伤因素,观察在自发痫性发作前这些损伤因素引起的病理过程,并研究大脑在癫痫各期的改变,对了解MTLE的病理生理特点及寻找新的药物治疗靶点至关重要。此外,发育期的大脑的结构与功能尚未发育成熟,与成熟的大脑比较,在癫痫致病因素、发生发展、临床和脑电图(EEG)表现、对抗癫痫药物的治疗反应性以及预后上亦存在很大区别。因此,有必要建立与小儿颞叶内侧癫痫发生发展相似的幼鼠慢性MTLE模型,这对研究海马发育早期阶段受损后产生成年期癫痫发作的发病机制及可能的早期干预措施有着十分重要的意义。
以往对MTLE的机制研究主要集中在神经再生和突触可塑性、离子通道、神经传递和信号传导、神经细胞损伤、细胞骨架的改变、细胞代谢和蛋白合成等各个方面。而由于血脑屏障的存在,长期以来,中枢神经系统(CNS)被认为是一个免疫豁免的场所,因此MTLE一直被认为是一个非炎症性疾病。然而近年来的研究表明炎症反应可能参与了MTLE的发生和发展。Toll-样受体-4(Toll-like receptor-4,TLR4)是固有免疫反应中能识别病原体成分的重要分子,在脑组织中主要表达于星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元上。通常情况下,TLR4与其配体结合后促使核转录因子κB(NF-kappaB,NF-κB)活化,导致白细胞介素-1beta(IL-1β)和肿瘤坏死因子-alpha(TNF-α)等炎症介质的生成,最终产生炎症反应。癫痫病人手术切除的海马组织中,TLR4、IL-1β及其受体表达增高,炎症细胞浸润增多。临床观察显示,在伴有海马硬化的颞叶癫痫成人患者中有相当高的比例可以追问到儿童早期有热性惊厥病史,且热性惊厥模型小鼠海马内IL-1β表达水平增高。对癫痫动物模型的研究发现,LPS-TLR4相互作用可促使大鼠产生痫样放电,而IL-1beta受体拮抗剂预处理后则能明显抑制LPS-TLR4的致痫作用。上述结果强烈提示:海马内的炎症过程,尤其是TLR4、IL-1β参与的炎症反应可能与MTLE的发生密切相关。因此,研究发育阶段幼鼠痫性发作后海马内TLR4、IL-1beta动态改变与癫痫发生发展的关系对明确炎症、免疫反应是否参与海马早期损伤及了解炎症在MTLE发生过程中各阶段的作用有重要意义,但目前国内外相关报道少见。
因此,本实验中,我们以21日龄(相当于人类婴幼儿阶段)幼鼠为研究对象,选用氯化锂联合匹罗卡品致痫,建立发育早期海马受损致成年后癫痫的大鼠慢性MTLE模型,并结合免疫组化、免疫印迹分析和RT-PCR的方法,检测MTLE不同时期海马组织各区域内TLR4,IL-1β表达水平的动态变化及该变化与海马硬化的关系,证实炎症反应是MTLE早期损伤因素,与海马硬化密切并参与了MTLE发病全过程。对此问题的探讨有助于从一个全新的角度研究MTLE的发病机制,不仅能从病因方面为MTLE的治疗提供新的靶点,还有可能寻找到MTLE慢性化过程中的生物学标志物,从而为预防MTLE的慢性化进程提供新的思路。
第一部分幼鼠慢性内侧颞叶癫痫模型的建立
目的:建立一种简单可靠、与人类癫痫发生发展特征相似的幼鼠慢性内侧颞叶癫痫模型。
方法:取165只3周龄健康SD幼鼠,随机分为癫痫模型组(E组)和对照组(C组)。癫痫模型组大鼠分别予3mEq/kg氯化锂腹腔注射,随后予30mg/kg匹罗卡品腹腔注射,以诱发大鼠出现痫性持续状态(SE)即“致痫”开始,于“致痫”开始后90分钟内对大鼠肌肉注射10mg/kg安定以终止发作。将存活的“致痫”SD大鼠随机分为3个亚组:E1组(SE后1.5小时),E2组(SE后3周),E3组(SE后8周),并按相应时间对各亚组内大鼠进行EEG(描记痫性放电)和海马组织形态学观察(Nissl染色了解大鼠神经元丢失情况以及Timm染色检测苔藓纤维出芽情况),并且从“致痫”开始,每日对存活的模型组大鼠进行行为学评分并记录自发痫性发作的频率和数量。对照组随机分为C1组,C2组,C3组3个亚组(与癫痫模型组亚组相对应),分别予3mEq/kg氯化锂腹腔注射,随后予以生理盐水(代替匹罗卡品)腹腔注射,后续实验及评估指标同模型组。
结果:癫痫模型组中,94.1％大鼠成功“致痫”,但死亡率达68.8％,“致痫"后8周存活大鼠中75％出现了反复自发痫性发作和EEG上尖波、棘波或棘慢波等痫样波发放。与之对应,对照组中各大鼠的行为学和EEG观察无异常。Timm染色结果显示致痫后1.5小时组大鼠海马内没有苔藓纤维出芽的改变,但致痫后3周及8周组大鼠海马CA3区和齿状回内分子层均出现明显的苔藓纤维出芽,其中致痫后8周组大鼠苔藓纤维出芽的现象更为明显,而对应时间的对照组大鼠海马组织内均未有苔藓纤维出芽。Nissl染色结果显示,与相应时间对照组比较,致痫后3周及8周组大鼠海马组织的DG,CA1和CA3区均出现明显的神经元丢失。
结论:1.本实验采用氯化锂.匹罗卡品联合致痫成功诱导出幼鼠慢性MTLE模型,75％的SE后存活模型鼠出现慢性自发性癫痫发作。
2.本实验所诱导的幼鼠慢性MTLE模型在发作形式、脑电图以及海马形态学改变等均符合人类MTLE的特征,为今后研究幼年期痫性发作对成年慢性MTLE的影响以及药物干预等提供了一个比较理想的实验性动物模型。
第二部分 MTLE各阶段TLR-4和IL-1β表达水平的动态变化
目的:了解MTLE各期大鼠模型海马组织不同区域内TLR-4和IL-1表达的动态变化,并探讨上述炎症相关介质与海马硬化的关系。
方法:同第一部分所述方法对SD大鼠进行分组,并建立幼鼠慢性内侧颞叶癫痫模型。采用免疫组化和免疫印迹的方法检测MTLE大鼠不同时期海马各组织区域内TLR-4表达水平,利用RT-PCR法测定IL-1β表达改变。
结果:MTLE模型组大鼠海马组织内早期(“致痫”后1.5小时组)即出现TLR4和IL-1β表达上调,并且该表现持续存在于MTLE发生发展各阶段(“致痫”后3周和8周组),此与MTLE大鼠海马DG,CA1和CA3区神经元坏死、丢失以及苔藓纤维出芽成正相关。
结论:1.本研究首次对幼鼠慢性MTLE模型不同发展阶段海马组织内TLR-4和IL-1β表达进行动态测定;比较发现,TLR-4和IL-1β在MTLE早期就有升高,提示炎症因素可能是启动MTLE的早期损伤因素。2.对MTLE不同阶段海马组织内TLR-4和IL-1β表达水平和海马硬化情况进行比较,发现TLR-4和IL-1β的高表达与神经元坏死、丢失以及苔藓纤维出芽密切相关,为今后通过药物治疗难治性MTLE提供一个新的视角。