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弧菌是各种海洋环境正常细菌区系的重要组成成分,其中多个种类是人类与水生动物的主要病原菌。本研究对广东大亚湾海域自然海水系统中的弧菌进行了大量的分离和鉴定工作,找到了其中的优势菌群,并对其进行了菌株分型及毒力基因调查研究工作。具体如下:
1.借助分子鉴定方法监测大亚湾水体中弧菌(Vibrio)种类季节性的动态变化规律。通过增菌培养、菌株分离,在224份海水中共分离出弧菌368株,并用分子生物学辅助生化鉴定方法鉴定弧菌菌株。结果表明:在大亚湾海域水体中出现的弧菌种类有溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus),没有检测到霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)和霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)。溶藻弧菌和副溶血弧菌为优势种群,分别占弧菌总数的27.99％和21.74％。
2.建立了副溶血弧菌的低频限制性位点PCR(Infrequent-restriction-site,IRS-PCR)分型方法,为副溶血弧菌的流行病学研究提供一种快速、有效的分型方法。应用IRS-PCR分型方法对40株副溶血弧菌进行了分子分型分析,并与脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型方法进行了比较。结果表明:40株副溶血弧菌用两种方法分型所得到的结果一致。在本实验中,IRS-PCR分子分型的分辨率高达0.953,与PFGE的分辨率接近,重复率达到100％。说明,本文所建立的利用NotI-HhaI双酶切的IRS-PCR分型方法是一种快速、有效,可用于副溶血弧菌基因分型的新型分型方法。
3.以副溶血弧菌和霍乱弧菌为阳性对照,调查了6个副溶血弧菌的毒力(相关)基因tlh、trh、tdh、toxR、toxRS、vppc及8个霍乱弧菌的毒力(相关)基因toxR、toxS、toxT、toxRS、zot、ace、ctxA、VPI在广东大亚湾海域水体及养殖系统中的60株溶藻弧菌中的分布情况,并应用IRS-PCR分型方法对其进行了分子分型分析,对溶藻弧菌毒力基因型与菌株来源及IRS-PCR图谱类型之间的关系进行了初步探讨。结果表明:96.7％的溶藻弧菌携带一种或几种毒力相关基因,推测溶藻弧菌可以成为其它弧菌毒力基因的保存库。不同来源的溶藻弧菌在此次分型中显示了不同的图谱类型,说明溶藻弧菌菌株间存在着明显的异源性,反映了弧菌进化过程中基因流动引起的遗传多样性；IRS-PCR图谱类型完全一致的菌株携带相同的毒力相关基因,不同的亚型略有差别；携带同一毒力相关基因的菌株可分属不同的IRS-PCR基因型。