论文部分内容阅读
原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是常见恶性肿瘤，由于起病隐匿，早期没有症状或症状不明显但进展迅速，确诊时大多数患者已经达到局部晚期或发生远处转移，治疗困难，预后很差，如果仅采取支持对症治疗，自然生存时间很短，严重地威胁人民群众的身体健康和生命安全。目前的治疗以手术、放化疗、介入性治疗、分子靶向药物治疗和中医药治疗为主。冬凌草甲素（Oridonin，ORI）提取自传统中药冬凌草，临床研究表明冬凌草甲素对食管癌、贲门癌、原发性肝癌和乳腺癌等肿瘤具有一定的疗效，延长患者生命。目前对冬凌草甲素抗肿瘤机制多集中于对肿瘤细胞的直接杀伤作用，包括诱导肿瘤细胞凋亡、增强其他抗肿瘤药物疗效等方面。近年来的研究结果显示冬凌草甲素还具有免疫调节作用，该分子在体内抗肿瘤作用中，是否还具有调节细胞免疫的功能，从而协同发挥抗肿瘤作用值得深入研究。 为此，本研究将采用细胞学和实验动物模型，深入探讨水溶性冬凌草甲素对小鼠肝癌细胞系H22细胞的抗肿瘤作用及其相关细胞免疫应答机制。包括采用不同浓度的ORI作用于体外培养的H22细胞，用CCK-8法测定ORI对H22细胞增殖的抑制作用；用Annexin V-FITC/PI双染色法检测H22细胞的凋亡率；利用C57BL/6J小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型，设立荷瘤对照组（PBS组）、ORI高、中、低剂量组（75、50、25mg/kg/天）、阳性对照组（5-Fu组）和空白对照组(NC组)，连续腹腔注射给药12天后处死后，以瘤重、抑瘤率观察ORI对移植瘤生长的影响；常规HE染色，光镜下观察 H22肝癌组织病理学改变；采用乳酸脱氢酶（LDH)释放法检测不同组别荷瘤小鼠脾脏细胞对小鼠H22细胞杀伤活性；流式细胞术（FCM）检测小鼠脾脏细胞中CD4+T细胞分泌IL-17、IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子能力的影响，检测CD8+T和 CD4+T细胞表面PD-1的表达。并采用体外实验，检测小鼠脾脏细胞在抗小鼠抗CD3/CD28磁珠刺激条件下，测定不同浓度（4.0μg/ml和8.0μg/ml）的ORI处理后小鼠脾脏细胞分泌IL-17、IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平和对小鼠H22细胞杀伤活性。 结果显示，冬凌草甲素可在体外显著抑制H22细胞的生长，诱导细胞发生凋亡，呈明显的量-效与时-效关系(P<0.01)；同时ORI的体内抑制试验结果显示低、中、高剂量ORI处理组的抑瘤率分别为32.51％、40.02%、52.51%，与未处理荷瘤对照组相比均有不同程度的缩小(P<0.05)；ORI能明显提高荷瘤小鼠脾脏细胞对H22细胞的杀伤活性(P<0.05)，抑制CD4+T细胞中细胞因子的分泌，尤其对IL-17和IL-2的抑制最为明显，对TNF-α和IFN-γ抑制在ORI高浓度情况下发挥作用；同时，ORI处理组中CD8+T细胞的PD-1表达降低，而CD4+T细胞表面PD-1的表达呈现一定程度的上调。上述ORI对荷瘤小鼠淋巴细胞的免疫调节作用在体外实验中也得到验证，即ORI体外处理抗CD3/CD28磁珠活化的小鼠脾脏细胞后，能显著抑制小鼠淋巴细胞因子分泌IL-17、TNF-α、IFN-γ的水平（P<0.05）。可提高体外抗CD3/CD28磁珠刺激下的小鼠脾脏细胞对H22细胞的杀伤活性。 综上所述，冬凌草甲素在体内和体外对小鼠H22肿瘤细胞均有明显的抑瘤作用，除了直接的杀伤作用外，还可以利用 T细胞抗肿瘤免疫应答机制协同促进对肿瘤的抑制作用。