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任何哺乳动物物种的生存和繁殖都依赖于两性配子的产生以及两性配子结合形成胚胎。成年雄性动物配子来源于精原干细胞，睾丸中的A_s型精原细胞是精原干细胞，在成年动物的整个生命期内，精原干细胞能够自我维持并持续地产生分化细胞。精原干细胞可以体外培养、冷冻保存及移植，还可以进行基因操作，并能将外源基因稳定地传递给后代。因此研究精原细胞特别是其中的精原干细胞对于动物种质资源的长期保存及开发利用、挽救濒危动物、生产具优良性状的家畜、生产转基因动物、治疗不育症以及研究精子发生过程及调控机制等具有重要意义。精原干细胞是继造血干细胞之后又一个可以进行功能检测的成体干细胞，也是唯一可以从形态上根据细胞间桥进行识别的一种干细胞，因而精原干细胞也是研究成体干细胞生物学的有利模型。为了研究和利用精原细胞，虽然已经进行了几十年探索，但仍没能建立起既能长期存活又能增殖的精原细胞体外培养体系，主要原因在于①目前尚无形态学、生物化学及免疫学方法对精原干细胞进行鉴定，除能采用克隆法检测细胞群体中有精原干细胞存在外，尚不能明确鉴定培养体系中的精原干细胞。②虽然能分离到高纯度精原细胞，但其中仅有少量精原干细胞。③精原干细胞更新分化的调节因素尚不明了。最新的转基因小鼠研究显示胶质细胞源神经营养因子(GDNF)很有可能是精原干细胞更新分化的一种调节因子。为了建立小鼠精原干细胞体外长期存活并增殖的培养体系，配合精原细胞冷冻保存技术，使离体精原干细胞能够长期存活并增殖，最终为各种动物精原干细胞以及其他成体干细胞的长期保存和利用提供干细胞研究模型，本研究以昆白系小鼠为实验动物，主要研究了①精原干细胞体外鉴定、检测方法、体外培养生物学、体外增殖途径及精原细胞冷冻保存方法；②采用分子克隆方法获取精原干细胞增殖所需生长因子——小鼠GDNF(mGDNF)的途径。 精原细胞体外培养及鉴定研究 采用胶原酶和胰蛋白酶顺次消化法，分别解离6日龄(dpp)、25dpp及成年隐睾生精上皮成为单细胞，采用简单培养液(DMEM+10％FCS+4mmol／L谷氨酰胺)，将生精上皮单细胞悬液接种于STO或BRL饲养层上，于32℃或37℃条件下进行精原细胞与支持细胞共培养，每间隔一定时间，置倒置显微镜下观察，或进行碱性磷酸酶(AP)组化染色检测、鉴定精原细胞。细胞接种后一周内，分化型精原细胞及其他类型生殖细胞经短暂存活和分裂后逐渐消失，培养体系中仅保留下少量对培养环境具有极强耐受力的精原细胞。它们在随后的培养过程中，不表现明显的分裂活动，能在体系中长期存活至少2个半月，并可以进行继代培养或经冷冻保存后继续培养。它们呈圆形，单个、双个或数个成串或成团，贴于支持细胞之上，或位于支持细胞形成的胞质凹陷中，与支持细胞连结紧密，不易随换液丢失。成串／团的精原细胞形成合胞体。AP组化染色显示这些细胞的胞膜和胞质呈阳性反应，细胞呈圆形或椭圆性，核质比大，核呈圆形或椭圆性。根据A_s精原干细胞理论及干细胞生物学特性，它们极有可能就是精原干细胞及其最初几代分化细胞。以6dpp小鼠、25 dpp及成年隐睾生精上皮细胞，采用STO或BRL饲养层、32℃或37℃培养，均可以建立精原干细胞长期培养体系，但25 dpp及成年隐睾培养体系比6 dpp培养体系具有更多一些的精原干细胞。此外，冷冻保存的6 dpp小鼠生精上皮细胞的培养结果与新解离的6 dpp细胞培养结果相似。在培养液中添加2 ng／mL、20ng／mL及100ng／mL人胶质细胞源神经营养因子(hGDNF)，对25dpp小鼠精原细胞培养25d～30d，培养体系中精原干细胞的数量随GDNF浓度增加而增加，当GDNF为100ng／mL时，培养体系中的精原干细胞数量增加8倍。结论：①6 dpp至成年小鼠的生精上皮细胞在有STO或BRL饲养层时，32℃或37℃，均可建立起精原干细胞长期存活的培养体系，其中 25 dpp及成年隐睾培养体系更有利于精原干细胞存活；②长期存活的精原干细胞仍保持有 AP活性，可利用 AP组化染色方法结合细胞形态进行检测；＠在建立精原干细胞长期存活的体外培养体系时，同时需要饲养层细胞和成年型支持细胞；④GDNF能促进体外培养体系中精原干细胞增殖。 由于体外培养实验证实GDNF能促进精原干细胞更新增殖，故进行了mGDNF的克隆及原核表达研究。从新生仔鼠脑组织中提取总RNA，以RT－PCR方法获得mGDNF成熟蛋白 cDNA，测序后，将mGDNP cDNA重组人含T7启动子的原核表达载体pET28a，构建原核表达质粒 mGDNRpET28a，转化大肠杆菌 DE3（BLZI）获得表达菌株 mGDNHDE3，经IPTG诱导，能以包涵体形式表达mGDM。由于时间关系，尚未对表达蛋白进行提取、纯化及复性工作。 精原细胞冷冻保存研究 采用含5％、10％、15％、20％及25％浓度的DMSO、丙H醇、乙二醇及甘油的冻存液，对6dpp－7dpp小鼠生精上皮单细胞进行慢速冷冻，液氮保存，37℃水浴复苏，台盼蓝染色检查细胞复苏率。结果，抗冻剂DMSO、丙二醇及乙二醇的浓度分别为10％时，能获得的最高细胞复苏率分别为88．2％、84．3％及sl．6％，其中精原细胞分别占18．4％、17．3％及16．8％，与新解离细胞对照组17．0％相比，均?