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牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由Ⅰ型牛疱疹病毒(bovine berpesvirus-1，BHV-1)引起牛的一种以上呼吸道炎症为主的接触性传染病，临床表现多种多样，以鼻气管炎、眼结膜炎、高热、流产、传染性脓疱为主要特征。BHV-1基因组为138kb的线性双股DNA分子，分成长独特区(UL，106kb)和短独特区(Us，10kb)，后者被两个反向重复序列(IR_s，TR_s各为11kb)隔开，重复序列变异性较大。立即早期基因IER4.2就位于其中，编码与单纯疱疹病毒(HSV-1)ICP4同源的转录调控蛋白BICP4。各种疱疹病毒ICP4的Ⅱ和Ⅳ区高度保守，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ区同源性较低。为了比较不同病毒株重复序列的差异性，根据已发表的BHV-1 K22毒株重复序列IRs中BICP4的基因序列设计了一对特异性引物，以BICP4 Ⅰ区中部分序列为靶标，对分离自不同牛种、不同部位的洛精株、美精株、B7株、V125株和BarthaNu／67株BHV-1基因组进行PCR扩增，均得到约540bp的片段，将其克隆、测序并与K22株进行同源性比较。结果显示，六株病毒的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均在98％以上，表明本实验所分离的这些毒株重复序列中的早期基因高度保守，在一定程度上显示出BHV-1的相对保守性。 糖蛋白gD是BHV-1的主要结构蛋白和免疫保护性抗原之一，在致病和免疫机制中发挥着重要作用。洛精株是从我国洛阳种牛场西门塔尔牛精液中分离的IBRV。本文根据已发表的BItV-1 P8-2毒株gD糖蛋白基因的核苷酸序列设计了一对特异性引物，对洛精株IBRV gD基因进行PCR扩增、克隆和测序。序列分析结果表明，本实验已成功地获得了BI-IV-1洛精株gD全基因序列，共1251bp，编码417个氨基酸残基。序列比较分析结果显示，IBRV洛精株的gD基因核苷酸序列与国外发表的BHV-1 P8-2株gD基因序列只有一个核苷酸碱基的差异，其同源性高达99.92％，所编码氨基酸的同源性为100％，即该碱基的突变并未引起氨基酸的变化。由此表明了BHV-1 gD基因的高度保守性。 鉴于gD糖蛋白基因的高度保守性及良好的免疫原性，可用其作为靶抗原构建重组表达质粒，有望用于生产有潜力的亚单位疫苗或基因疫苗。本研究将已获得的IBRV gD基因再亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中，获得重组质粒pcDNA-gD。将此表达质粒单独或连同脂质体免疫BALB／c小鼠，用ELISA法检测血清抗体水平。结果表明，含IBRV gD基因的表达质粒单独注射及连同脂质体混合注射的小鼠均可检测到特异性抗体，且后者强于前者，而对照组无此反应。本试验为探讨我国IBRV分离株的生物学特性及进一步研制基因疫苗提供了理论和实验基础。 用活病毒作为载体表达其它病原的保护性抗原基因为改进现有的常规疫苗提供了契机，成为疫苗学很有发展前景的领域之一。国外已有用BHV-1作为载体表达其它病毒保护性基因的成功先例。本研究将IBRV LA株DNA HindⅢ A片段中的SaiⅠ-SalⅠ亚片段李继昌 牛传染性鼻气管炎重组疫苗的基础研究2002年5月 （含 TK基因）克隆到质粒pBluescript SK中，再用 Bglll和 Sacl切去 347be，获得含TK基因部分缺失的重组质粒pdTK，然后用Hindlll和Xbal切去其中的多克隆位点；将来源于PCR3－Ufli的p启动子、多克隆位点和BGH POlyu）信号尾插入PdTK质粒的XhOI位点上，构建了通用IBRV转移载体pdTKod，可用来表达其它牛呼吸道病毒基因，如牛副流感病毒（BPIV3）、牛呼吸道综合症病毒（BRSV）和牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等，从而开辟一条开发利用BHV－二载体资源的途径。 牛流行热是由牛流行热病毒（BEFV）引起牛的急性热性传染病。感染牛表现为急性发热、呼吸道和消化道机能障碍以及踱行和肢体僵直。外膜糖蛋白G基因位于病毒表面并含有中和抗原表位，可使牛产生免疫保护力。本试验将克隆到 pBluescript SK中的BEFV G基因亚克隆到含有 p启动于和 POly（A）信号尾的批R3Allli载体上，获得 PTA－－G重组质粒，用Haed酶切后将含有CMV、G蛋白基因和Polyu）的目的片段（大约3．6Kb）插入通用转移载体PdTtw中，获得10．ZKb大小的PdTK－－CMBAI重组质粒；再将含SV40启动子的LacZ报告基因也亚克隆到该载体获得ndTKthacZ－－G转移载体。通过脂质体方法转染由 IBRV Bartha株感染的 MDBK细胞，筛选蓝色蚀斑进行重组病毒的蚀斑纯化。通过PCR方法鉴定证明该重组病毒基因组中含有完整的牛流行热病毒G蛋白基因，为下一步制备 IBRV／BEFV二价基因工程疫苗，以及基于此的多价疫苗奠定了基础。 总之，本研究对牛传染性鼻气管炎病毒部分重复序列进行了同源性分析，首次克隆和测定了我国IBRV洛精株gD基因的核昔酸序列，又构建了gD真核表达质粒，接种小鼠能诱导免疫抗体反应，并构建了 IBRV通用转移载体和 BEFV gG重组 IBRV，为揭示 IBRV的流行病学及研制新型疫苗提供了重要依据。