论文部分内容阅读
戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)是一种无包膜的RNA病毒，主要可引起急性戊型肝炎（HepatitisE，HE），会造成消化道相关的食欲不振、恶心、呕吐等症状，严重的患者甚至会发生肝衰竭乃至死亡，尤其在育龄期妇女、慢性肝病患者、老年人和婴幼儿中有着较高的病死率，是一种严重威胁人类健康的病原体，引起了众多研究者的关注。
由于缺乏有效的HEV细胞培养模型，对HEV的病毒颗粒组装、感染机制研究和疫苗开发主要是通过各种外源表达系统进行的。HEVORF2aa112-606编码的蛋白(p495)可在昆虫细胞中体内组装成等二十面体对称的病毒样颗粒（VirusLikeParticle，VLP），但体外重组装和利用大肠杆菌表达系统获得该蛋白片段的病毒样颗粒等未见报道，体外组装可控制核酸的包裹，从而制备具有感染和入胞能力的假病毒，可用于病毒-细胞相互作用、病毒入胞机制、病毒受体研究和疫苗效力评价，本研究在课题组成功研制世界上第一个重组戊型肝炎疫苗p239的基础上，利用原核表达系统开展p495蛋白的表达、体外组装、免疫原性和假病毒包装等研究，以期为戊型肝炎病毒的研究提供新的工具。
首先，本研究利用大肠杆菌表达系统可溶性表达p495蛋白，并通过突变分析发现，Leu244为p495蛋白可溶性表达的关键位点。采用阴离子交换层析等方法获得纯度约90％的p495蛋白，通过摸索蛋白颗粒组装的条件，包括组装时溶液的pH、盐离子浓度和温度等，确定20-50mMPB6.5、0.5MNaCl、37℃是p495的颗粒体外组装的较优条件，并发现Pro284为p495蛋白组装的关键位点之一。
其次，透射电镜观察和动态光散射测定显示，p495可形成为形态均一、半径为15rim左右的VLP;免疫反应性分析表明，p495与各种HEV特异单抗反应性良好，与p239的反应性相当;p495在小鼠体内的半数有效剂量(ED50)为0.068μg，0.5μg剂量可诱导的小鼠抗体水平为105，与已上市的p239疫苗Hecolin(@)免疫原性相当。
再次，细胞入胞实验表明，p495可吸附并进入HEV易感细胞HepG2，将能够表达GFP的质粒载体与其进行共组装，采用HPLC分子筛的双波长紫外检测和组装颗粒的细胞感染实验，提示p495可包裹质粒DNA，并在细胞内表达GFP报告基因，显示了用于制备HEV假病毒的可行性。
综上所述，本研究首次利用大肠杆菌可溶性表达了HEVp495蛋白，其中的Leu244和Pro284分别在可溶性表达和颗粒组装中起重要的作用，组装获得形态均一的病毒样颗粒，具有良好的免疫反应性和免疫原性，这些颗粒可感染细胞或包裹质粒DNA在细胞内表达报告基因。从而，为HEV的衣壳组装机理、细胞感染机制、受体鉴定等研究奠定了良好的基础，为基于大肠杆菌的戊肝病毒的疫苗设计提供新的参考，假病毒的应用将推动HEV细胞模型和动物模型的发展。