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上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤,是女性生殖系统致死性最高的疾病。腹膜广泛种植和转移是晚期或复发EOC病例的一个显著的病理特征。EOC腹膜表现出类似慢性炎症的微环境特征,基质浸润数量丰富的巨噬细胞,腹膜组织的凝血系统也处于激活状态,具体表现为:凝血因子Ⅱ(凝血酶)、Ⅲ(组织因子)、Ⅶ、Ⅹ和Ⅻ因子等的高表达,其受体亦表达上调。巨噬细胞表面凝血酶作用的受体,PAR1,PAR3,PAR4均有表达。然而,凝血酶和巨噬细胞间相互作用对EOC腹膜种植、转移及肿瘤进展的机制尚不清楚。本课题研究了凝血酶刺激后外周血来源单核/巨噬细胞(monocyte/macrophages,MO/MAs)表型和功能的改变,及其对EOC细胞系ES-2,SKOV3,HO-8910细胞侵袭能力的影响,筛选参与这一过程的信号转导通路,并且与EOC腹水来源的肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)作比较。结果显示:凝血酶刺激后,MO/MAs分化为具有类似TAMs样细胞特征的 M2型巨噬细胞亚型,其分泌型和表型为CD163highIL-10highCCL18highIL-8high；凝血酶刺激MO/MAs后的上清显著增强ES-2,SKOV3及HO-8910细胞体外侵袭能力,IL-8作为趋化因子在其中发挥了重要作用,炎症和肿瘤家族多个转录因子在这一过程中表达增高,NF-κB p50/p65磷酸化激活。本课题的研究结果揭示了EOC微环境内激活的凝血酶通过诱导MO/MAs分化和极化促进了肿瘤细胞侵袭和转移。
第一部分凝血酶诱导单核细胞/巨噬细胞分化为上皮性卵巢癌腹膜内肿瘤相关样巨噬细胞
目的:探讨激活的凝血酶能否诱导外周血MO/Mas分化为EOC腹膜微环境肿瘤相关巨噬细胞TAMs。方法:分离正常女性外周血MO/Mas以及EOC腹水内TAMs,凝血酶刺激后,检测MO/Mas和TAMs表面凝血酶受体PAR1、3、4表达,分析MO/Mas在凝血酶或(凝血酶+凝血酶特异性抑制剂-水蛭素)刺激后CD14、CD68和CD163表达比例,ELISA检测TAMs及凝血酶刺激后MO/Mas表达的细胞因子,Real-time PCR检测细胞因子、趋化因子mRNA表达。结果:MO/Mas及TAMs细胞表面上均有凝血酶受体PAR1、3、4表达:凝血酶刺激后,MO/Mas高表达CD163(3.82±1.93)％,与凝血酶+水蛭素刺激组(0.56±0.28)％及培养液对照组(1.02±0.38)％相比差异有统计学意义(p<0.05,n=3):ELISA结果示:凝血酶刺激后IL-8、IL-10及TGF-β分泌表现出时间依耐性特征,刺激后3h表达量达高峰,IL-12分泌在12h达峰值:Real-time PCR显示IL-8、IL-10、IL-12、CXCR2、CCR2、CCL18 mRNA表达上调,CXCR1和TGF-β表达下降；结论:激活的凝血酶能诱导外周血MO/Mas表型和分泌型分化为CD163highIL-10highCCL18highIL-8high,为具有类似TAMs样特征的M2型巨噬细胞亚型,凝血酶可能参与了EOC腹膜微环境MO/Mas向TAMs细胞分化和极化作用的过程。
第二部分
目的:研究凝血酶刺激正常人外周血来源MO/gas后对卵巢癌细胞侵袭力的影响及筛选参与其中的转录因子。方法:分离MO/Mas后,印度墨汁吞噬试验检测其吞噬功能的变化；以凝血酶刺激MO/Mas后的上清为趋化物,检测其对卵巢癌细胞系ES-2,SKOV-3及HO-8910体外侵袭能力的影响；转录因子试剂盒AP1、STAT、Inflammation1、Oncogene3家族筛选参与这一过程的转录因子,Western-blotting验证。结果:凝血酶未显著提高MO/Mas的吞噬能力；基质胶体侵袭实验表明EOC细胞系ES-2在(MO/Mas+凝血酶)刺激组上清作用下,侵袭能力增强(161.9±11.18,n=4),其侵袭细胞数目与卵巢癌腹水刺激组(157.5±14.86,n=4)类似,但显著高于阴性对照组普通培养基(47.25+12.45,P<0.05),添加水蛭素后能显著降低其侵袭能力(73.5±17.3,P<0.01)；抗IL-8单克隆抗体对ES-2细胞侵袭的阻断作用呈浓度依耐性,相同体外侵袭实验在SKOV-3细胞系(n=3)及HO-8910细胞系(n=3)中得到类似结果；转录因子检测示Inflammation1及Oncogene3家族中几乎所有涉及炎症的转录因子包括C-fos,C-Rel,NF-κ b-P50,NF-κ b-P65等在凝血酶刺激MO/Mas后活性增加(n=4),NF-κB p50/p65磷酸化激活。结论:凝血酶刺激MO/Mas通过上调IL-8产生,显著增强卵巢癌细胞的侵袭力,表明卵巢癌腹膜内凝血酶可能通过“教育”和诱导MO/Mas向TAMs样细胞分化后,加速肿瘤细胞腹膜内转移。