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端粒酶逆转录酶(TERT)是端粒酶(Telomerase)的核心成分，TERT具有激活端粒酶活性的作用，可以使已分化的细胞向着持续分裂的肿瘤细胞转变，所以在人体内正常细胞中的TERT活性受到严格的控制，但在膀胱癌和脑胶质瘤等多种恶性肿瘤细胞中都发现了TERT突变的启动子，而ETS家族转录因子GABPA及其伴侣GABPB1可以协同激活这些肿瘤细胞中突变的TERT启动子的活性从而导致细胞中端粒酶的活性增强。已有研究证明下调肿瘤细胞中GABPA/GABPB1复合物的含量可以抑制端粒酶的活性，从而消除胶质细胞瘤细胞的恶性潜能。所以GABPA/B1被认为是一个肿瘤治疗的靶点。然而在膀胱癌的发病机制中GABPA所扮演的角色尚不明确。我们在研究初期认为GABPA在膀胱癌中同样扮演一个致瘤因子的角色，然而通过进一步的研究我们却意外地发现膀胱癌细胞中GABPA表达下降虽然会抑制TERT的表达，但同时会显著增强膀胱癌细胞的增殖、侵袭、干细胞特性以及对抗肿瘤药物顺铂的耐药性，而当其表达增高时则出现相反的结果。并且在裸鼠膀胱癌异种移植模型中，过表达GABPA的膀胱肿瘤细胞在小鼠体内的转移侵袭能力明显被抑制。通过进一步研究，我们发现GABPA会直接激活驱动尿路上皮细胞进行管腔分化的关键转录因子FoxA1和GATA3的转录活性，这一点提示GABPA可能与膀胱癌管腔分化相关。通过分析TCGA/GEO数据库中的临床病例信息，我们发现管腔亚型膀胱癌中GABPA表达显著高于基底亚型膀胱癌，并且结合TCGA数据库中的病例信息和我们自己收集的膀胱癌患者资料分析，可以看出当膀胱癌患者体内GABPA基因的表达量较低时，其生存期显著缩短。所以，尽管GABPA可以促进TERT的表达，从而有可能诱导癌症的发生，但是GABPA通过调控膀胱癌细胞管腔分化的特征基因FoxA1和GATA3的表达，可以促进细胞的管腔性分化从而抑制膀胱癌向侵袭性程度和增殖能力更强的基底亚型发展。所以我们认为GABPA在膀胱癌中起着抑癌作用。
研究目的:
通过调控GABPA在膀胱癌细胞中的表达，从而研究其对TERT活性的调节作用以及观察GABPA在膀胱癌细胞中是否可以通过刺激FoxA1和GATA3的转录表达从而促进膀胱癌的管腔分化，同时通过干预膀胱癌细胞中GABPA的表达，从而观察GABPA对膀癌细胞的增殖、侵袭、干细胞特性、以及其对顺铂耐药性的影响。通过研究GABPA在分子生物学层面对膀胱癌的发生和发展过程中的具体作用，可为膀胱癌的诊断和治疗提供新的靶标。
研究方法:
(1)通过分析TCGA和GEO数据库中的病例资料，我们比较了膀胱癌患者中不同的病理类型(管腔亚型和基底亚型)中的GABPA与TERT、以及GABPA与FoxA1/GATA3的mRNA的表达的相关性。
(2)将2006年至2016年在山东大学第二医院接受手术的112名膀胱癌患者纳入研究。并用免疫组织化学技术检测膀胱癌病理样本的石蜡切块中GABPA和FoxA1表达含量，以及GABPA和FoxA1表达相关性。
(3)通过培育三种膀胱癌细胞(J82、SW1710、HT1197)从而建立比较全面的细胞层面的样本，并且在这些细胞系中通过转染GABPAsiRNA或者GABPA过表达质粒从而敲降或者上调GABPA在这些细胞中的表达，48h后提取细胞中的RNA、72h后提取细胞内的总蛋白，并且通过实时定量PCR技术以及western-blot技术检测敲降或者过表达的效果，然后再用RT-PCR技术以及蛋白印迹技术检测上述干预之后的这些细胞中的TERT的mRNA的水平的变化以及FoxA1/GATA3的mRNA和蛋白水平的变化，并通过ChIP验证GABPA对FoxA1和GATA3的转录是否存在激活作用。同时用BrdU、细胞流式、Trans-well、顺铂耐药等实验检测调节GABPA表达之后的膀胱癌细胞的增殖、侵袭特性和顺铂耐药性的变化。
(4)通过将稳定过表达GABPA的J82细胞(J82/GABPA)和空载体对照细胞(J82/control)经尾静脉注射至6周龄的雄性BALB/c裸鼠体内，并在10周之后处死小鼠，收集小鼠的肝脏、肺脏等器官，并用BOUINS固定液处理，通过HE染色，以及免疫组织化学技术检测切片中ki67的表达评估肿瘤在小鼠体内侵袭、转移情况，从而判断GABPA在活体内对膀胱肿瘤细胞的侵袭转移能力的影响。
(5)统计学方法:Studentsttest、Mann-WhitneyU-test、Chi2-test、Fishersexacttest用于单一变量分析。SpearmansRank-OrderCorrelation确定相关系数p和P值。OS和DFS用KaplanMeier图显示，生存分析采用log-rank检验。使用medianseparation将GABPA转录本的水平分为高表达组和低表达组。所有检验均为双侧检验，P值＜0.05具有统计学意义。
研究结果:
(1)通过分析TCGA数据库中资料，我们发现GABPA在管腔亚型膀胱癌中的表达显著高于基底亚型的膀胱癌，这两种亚型中TERT的表达无显著的差异。并且在两种亚型中TERT与GABPA并无显著相关性。
(2)通过免疫组织化学(IHC)技术检测膀胱癌患者的肿瘤组织内GABPA和FoxA1蛋白表达水平，我们发现在BC肿瘤中GABPA与FoxA1蛋白表达呈显著正相关性。
(3)在膀胱癌细胞J82、SW1710、HT1197中，在调控GABPA的表达之后，我们观察到细胞中FoxA1和GATA3的表达变化与GABPA变化一致，这一现象提示GABPA具有调控FoxA1和GATA3表达的功能，接下来我们用ChIP验证了GABPA可直接结合于FoxA1和GATA3的启动子区域并激活其转录。与此同时我们也将CDKN1A和CDKN1B这两个FoxA1和GATA3的已知的下游靶基因也纳入了观察的范畴，我们发现CDKN1A和CDKN1B也与GABPA的表达与FoxA1和GATA3一致都是呈正相关。
(4)在BrdU以及细胞流式实验中可以观察到，当肿瘤细胞中GABPA的下调时会导致肿瘤细胞的增殖能力显著提高，反之当细胞内转入GABPA过表达质粒时，膀胱癌细胞的增殖能力明显受到抑制。在Trans-well实验中转染GABPA的siRNA的膀胱癌细胞与对照组相比较，其侵袭特性明显增强，在转染GABPA表达质粒之后，肿瘤细胞的侵袭性与对照组相比则显著下降。在顺铂耐药实验中，我们在敲降了膀胱癌细胞中的GABPA的表达后发现，与对照组相比，其对顺铂的耐药性明显增强。
(5)在动物成瘤模型中，我们将过表达GABPA的细胞(J82/GABPA)及对照组(J82/control)经尾静脉注射到两组裸鼠(6只/组)中。10周之后处死小鼠，收集肝脏、肺脏等器官，对组织进行HE染色和BOUINS固定液处理，同时通过免疫组织化学检测小鼠组织中的ki67表达，我们发现在GABPA过表达组的裸鼠模型中，膀胱癌细胞的在小鼠体内的转移受到明显的抑制。
研究结论:
(1)通过分析TCGA数据库中的病例资料，我们认为GABPA在膀胱癌的管腔亚型中表达更高，所以我们认为GABPA具有诱导膀胱癌细胞向管腔亚型分化的作用。根据GABPA在膀胱癌患者中的表达情况以及我们对于纳入研究的患者的随访观察的结果，可以看到GABPA过表达组的生存率以及预后要明显优于低表达组，所以我们认为GABPA在肿瘤组织中的表达量对于患者的生存以及预后有重要意义。
(2)GABPA通过调控FoxA1和GATA3这两个控制细胞管腔分化的转录因子的表达从而促进膀胱癌的管腔性分化，因此GABPA对于膀胱癌的管腔分化有促进作用，可抑制肿瘤向肌层浸润，形成恶性程度更高的基底亚型。
(3)上调肿瘤细胞中GABPA表达之后，显著降低了膀胱癌细胞的增殖、侵袭能力，提升了顺铂对膀胱癌细胞的杀灭作用。
(4)在动物活体实验中，与对照组相比，过表达GABPA的膀胱癌细胞在裸鼠体内转移受到了明显的抑制作用。
(5)通过上述研究结果我们认为GABPA在膀胱癌的发病机制中是作为抑癌因子发挥作用的，所以在膀胱癌的治疗中并不应该将GABPA列为治疗的靶点。并且检测膀胱癌患者中GABPA的表达量对于患者的预后具有重要意义。
研究目的:
通过调控GABPA在膀胱癌细胞中的表达，从而研究其对TERT活性的调节作用以及观察GABPA在膀胱癌细胞中是否可以通过刺激FoxA1和GATA3的转录表达从而促进膀胱癌的管腔分化，同时通过干预膀胱癌细胞中GABPA的表达，从而观察GABPA对膀癌细胞的增殖、侵袭、干细胞特性、以及其对顺铂耐药性的影响。通过研究GABPA在分子生物学层面对膀胱癌的发生和发展过程中的具体作用，可为膀胱癌的诊断和治疗提供新的靶标。
研究方法:
(1)通过分析TCGA和GEO数据库中的病例资料，我们比较了膀胱癌患者中不同的病理类型(管腔亚型和基底亚型)中的GABPA与TERT、以及GABPA与FoxA1/GATA3的mRNA的表达的相关性。
(2)将2006年至2016年在山东大学第二医院接受手术的112名膀胱癌患者纳入研究。并用免疫组织化学技术检测膀胱癌病理样本的石蜡切块中GABPA和FoxA1表达含量，以及GABPA和FoxA1表达相关性。
(3)通过培育三种膀胱癌细胞(J82、SW1710、HT1197)从而建立比较全面的细胞层面的样本，并且在这些细胞系中通过转染GABPAsiRNA或者GABPA过表达质粒从而敲降或者上调GABPA在这些细胞中的表达，48h后提取细胞中的RNA、72h后提取细胞内的总蛋白，并且通过实时定量PCR技术以及western-blot技术检测敲降或者过表达的效果，然后再用RT-PCR技术以及蛋白印迹技术检测上述干预之后的这些细胞中的TERT的mRNA的水平的变化以及FoxA1/GATA3的mRNA和蛋白水平的变化，并通过ChIP验证GABPA对FoxA1和GATA3的转录是否存在激活作用。同时用BrdU、细胞流式、Trans-well、顺铂耐药等实验检测调节GABPA表达之后的膀胱癌细胞的增殖、侵袭特性和顺铂耐药性的变化。
(4)通过将稳定过表达GABPA的J82细胞(J82/GABPA)和空载体对照细胞(J82/control)经尾静脉注射至6周龄的雄性BALB/c裸鼠体内，并在10周之后处死小鼠，收集小鼠的肝脏、肺脏等器官，并用BOUINS固定液处理，通过HE染色，以及免疫组织化学技术检测切片中ki67的表达评估肿瘤在小鼠体内侵袭、转移情况，从而判断GABPA在活体内对膀胱肿瘤细胞的侵袭转移能力的影响。
(5)统计学方法:Studentsttest、Mann-WhitneyU-test、Chi2-test、Fishersexacttest用于单一变量分析。SpearmansRank-OrderCorrelation确定相关系数p和P值。OS和DFS用KaplanMeier图显示，生存分析采用log-rank检验。使用medianseparation将GABPA转录本的水平分为高表达组和低表达组。所有检验均为双侧检验，P值＜0.05具有统计学意义。
研究结果:
(1)通过分析TCGA数据库中资料，我们发现GABPA在管腔亚型膀胱癌中的表达显著高于基底亚型的膀胱癌，这两种亚型中TERT的表达无显著的差异。并且在两种亚型中TERT与GABPA并无显著相关性。
(2)通过免疫组织化学(IHC)技术检测膀胱癌患者的肿瘤组织内GABPA和FoxA1蛋白表达水平，我们发现在BC肿瘤中GABPA与FoxA1蛋白表达呈显著正相关性。
(3)在膀胱癌细胞J82、SW1710、HT1197中，在调控GABPA的表达之后，我们观察到细胞中FoxA1和GATA3的表达变化与GABPA变化一致，这一现象提示GABPA具有调控FoxA1和GATA3表达的功能，接下来我们用ChIP验证了GABPA可直接结合于FoxA1和GATA3的启动子区域并激活其转录。与此同时我们也将CDKN1A和CDKN1B这两个FoxA1和GATA3的已知的下游靶基因也纳入了观察的范畴，我们发现CDKN1A和CDKN1B也与GABPA的表达与FoxA1和GATA3一致都是呈正相关。
(4)在BrdU以及细胞流式实验中可以观察到，当肿瘤细胞中GABPA的下调时会导致肿瘤细胞的增殖能力显著提高，反之当细胞内转入GABPA过表达质粒时，膀胱癌细胞的增殖能力明显受到抑制。在Trans-well实验中转染GABPA的siRNA的膀胱癌细胞与对照组相比较，其侵袭特性明显增强，在转染GABPA表达质粒之后，肿瘤细胞的侵袭性与对照组相比则显著下降。在顺铂耐药实验中，我们在敲降了膀胱癌细胞中的GABPA的表达后发现，与对照组相比，其对顺铂的耐药性明显增强。
(5)在动物成瘤模型中，我们将过表达GABPA的细胞(J82/GABPA)及对照组(J82/control)经尾静脉注射到两组裸鼠(6只/组)中。10周之后处死小鼠，收集肝脏、肺脏等器官，对组织进行HE染色和BOUINS固定液处理，同时通过免疫组织化学检测小鼠组织中的ki67表达，我们发现在GABPA过表达组的裸鼠模型中，膀胱癌细胞的在小鼠体内的转移受到明显的抑制。
研究结论:
(1)通过分析TCGA数据库中的病例资料，我们认为GABPA在膀胱癌的管腔亚型中表达更高，所以我们认为GABPA具有诱导膀胱癌细胞向管腔亚型分化的作用。根据GABPA在膀胱癌患者中的表达情况以及我们对于纳入研究的患者的随访观察的结果，可以看到GABPA过表达组的生存率以及预后要明显优于低表达组，所以我们认为GABPA在肿瘤组织中的表达量对于患者的生存以及预后有重要意义。
(2)GABPA通过调控FoxA1和GATA3这两个控制细胞管腔分化的转录因子的表达从而促进膀胱癌的管腔性分化，因此GABPA对于膀胱癌的管腔分化有促进作用，可抑制肿瘤向肌层浸润，形成恶性程度更高的基底亚型。
(3)上调肿瘤细胞中GABPA表达之后，显著降低了膀胱癌细胞的增殖、侵袭能力，提升了顺铂对膀胱癌细胞的杀灭作用。
(4)在动物活体实验中，与对照组相比，过表达GABPA的膀胱癌细胞在裸鼠体内转移受到了明显的抑制作用。
(5)通过上述研究结果我们认为GABPA在膀胱癌的发病机制中是作为抑癌因子发挥作用的，所以在膀胱癌的治疗中并不应该将GABPA列为治疗的靶点。并且检测膀胱癌患者中GABPA的表达量对于患者的预后具有重要意义。